معماری
اسپرم

آزمایش اسپرم (اسپرموگرام)

اختلالات تولیــــــــد اسپرم به تنهایی ۳۵ – ۳۰% موارد علل نـــــــــــازایی زوج را تشکیل می‌دهد، با این حال آزمایش کامل اسپرم و بررســـی آنتی‌بادی‌های اسپرم و تکنیــــک‌های پیشــــــــــــــرفته باروری ART (Advanced Reproductive Technology) و همچنین ارزیابی کامل باروری مردان کمتر انجام می‌شود. یکی از دلایل آن این است که روش‌های ART بیشتر توسط متخصصین زنان انجام می‌شود و آنها دسترسی کمتری به مردان دارند و از طرفی ارولوژیست‌ها نیز درگیری شغلی کمتری در استفاده از ART در ناباروری زوج‌ها دارند؛ به همین دلیل تست‌های پیشرفته ارزیابی اسپرم امروزه فقط در محدوده مراکز تحقیقاتی باقی مانده است و تست‌های روتین اسپرم نیز در بین مراکز مختلف در قالب یک استاندارد انجام نمی‌شود و نتایج بسیار متغیر است. یکی از روش‌های استاندارد کردن اسپرموگرام، اتوماسیون است. دو روش برای اتوماسیون وجود دارد؛ یکی استفاده از دستگاه‌های آنالیز اسپرم و دیگری استفاده از روش‌های کامپیوتری اسپرموگرام که به نام CASA (Computer Assisted Semen Analysis) معروف است. پیشنهاد WHO استفاده از CASA است.

 

اسپرموگرام Semen analysis

اسپرموگرام آزمایشی است که برای بررسی ناباروری مردان همراه یا بدون علائمی از اختلالات آندروژنی انجام می‌شود. کیفیت اسپرموگرام به دو متغیر بستگی دارد:

  • نحوه جمع‌آوری اسپرم
  • روش به کار گرفته برای آنالیز اسپرم

بنابراین دو متغیر بیولوژیکی و آنالیتیکی فوق باید در آزمایشگاه‌ها استاندارد شود تا به یک نتیجه یکسان در همه آزمایشگاه‌ها برسیم.

 

الف) جمعآوری اسپرم Semen Collection

جلوگیری ۲ تا ۷ روزه از فعالیت جنسی برای رسیدن به نتایج یکسان ضروری است. مشخص شده که کیفیت اسپرم بستگی به زمان و حالت‌های روحی روانی مرد دارد و برای شرایط جمع‌آوری اسپرم برای یکسان سازی اهمیت دارد. پیشنهاد می‌گردد اسپرم در آزمایشگاه و در یک اتاق مناسب که دارای دستشویی است جمع‌آوری گردد، در این صــــورت اشتباهات در زمان جمع‌آوری و حرارت نگهداری نمونه‌های منزل کاهش می‌یابد. تصمیم گیری در مورد غیر بارور بودن یک اسپرم پس از ۳ بار آزمایش و رعایت پرهیز ۲ تا ۷ روزه انجام می‌شود. جدول زیر حداقل مشخصات یک اسپرم بارور را نشان می‌دهد.

 

ب ) روش اسپرموگرام

اسپرموگرام باید بر اساس راهنمای WHO انجام شود که به شرح آن می‌پردازیم.

 

آزمایش‌های اسپرموگرام در سه سطح انجام می‌شود:

سطح ۱ آزمایشهای روتین با استاندارد اسپرموگرام: شامل ارزیابی‌های چشمی نما، PH، حجم، ویسکوزیته و Liquefaction یا مایع شدن است.

 

روشهای میکروسکوپی: شامل تجمع و آگلوتیناسیون اسپرم، وجود سایر سلول‌ها، حرکت اسپرم، زنده بودن اسپرم، مرفولوژی اسپرم، فعالیت پراکسیدازی لکوسیت‌ها (در صورت وجود لکوسیت) و تست آنتی‌گلوبولین مخلوط (MAR) در صورتی که تعداد زیادی تجمع و آگلوتیناسیون اسپرم وجود داشته باشد.

 

سطح ۲تستهای درخواستی: اندکس تراتوزوسپرمی(Teratozospermia) رنگ‌آمیزی CD45، تست نفوذ موکوس(Invitro) ، اندازه‌گیری مواد شیمیایی اسپرم

سطح ۳ تستهای تحقیقاتی: متابولیت‌های فعال اکسیژنی، تست نفوذ به Zona، تست‌های القای واکنش آکروزوم، تست نفوذ به اووسیت همسر

بر اساس راهنمای WHO تست‌های روتین و سطح یک در تمامی افراد مورد ارزیابی باید انجام شود. تست‌های درخواستی و تحقیقاتی، موردی و در شرایط خاص درخواست می‌گردد.

 

آزمایشهای روتین و یا سطح یک

الف) بررسی چشمی مایع اسپرم

مایع منی نرمال یکدست و شیری متمایل به خاکستری است که معمولاً در حرارت اتاق و در زمان ۲۰ دقیقه به حالت مایع درمی‌آید. علت بسته شدن مایع وجود مادهCoagulum و علت مایع شدن آن به دلیل آنزیم PSA‌ است. اگر اسپرمی حالت بسته را نداشت فاقد کوآگولوم می‌باشد.

اگر مایع بیشتر به رنگ سفید متمایل باشد نشان از اسپرماتوزوئید کم و یا لکوسیت بالاست. رنگ متمایل به زرد نشان از وجود سلول‌های چرکی و عفونت است. رنگ قهوه‌ای یا قرمز نشان از وجود خون و RBC یا (Hemospermia) است. قبل از هرگونه آزمایش باید مایع کاملاً تکان داده شود تا یکدست گردد.

PH‌ برابر ۸ درست پس از مایع شدن، نشان از عفونت است. باید توجه داشت زمان سبب رها شدن Co2 و افزایش PH می‌گردد. PH کمتر از ۷/۷ همراه با آزوسپرمی (Azospermia) نشان از انسداد مجاری اپیدیدیم و مجرای وابران، مجاری سمینال و مجاری اجوکولاسیون است.

 

بررسی میکروسکوپی مایع اسپرم

بررسی میکروسکوپی از نمونه تازه که رقیق نشده و ترجیحاً با میکروسکوپ فاز کنتراست انجام می‌شود. حدوداً ۵/۶ لاندا اسپرم را روی اسلاید شیشه‌ای که قبلاً گرم شده می‌گذاریم و با لامل ۱۸×۱۸ می‌پوشانیم. در این حالت فضایی به عمق μm 20 ایجاد می‌کنیم که در این فضا اسپرماتوزوئیدها به راحتی می‌توانند حرکت کنند و از طرفی در دید میدان میکروسکوپی نیز قرار می‌گیرند.

 

  • تجمع یا آگلوتیناسیون اسپرمها

الف) تجمع یاaggregation : عبارتست از چسبیدن اسپرماتوزوئیدهای حرکت‌دار یا بدون حرکت به بقایای سلولی و یا مواد موجود در مایع. تجمع ارزش چندانی ندارد و سبب ناباروری نمی‌شود.

ب) آگلوتیناسیون agglutination : عبارتست از چسبیدن اسپرماتوزوئیدها با یا بدون حرکت به یکدیگر. اگر مقدار آن زیاد باشد احتمال وجود آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم و ناباروری ایمونولوژیک مطرح است و با تست MAR یا واکنش آگلوتیناسیون مخلوط آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم را می‌توان تأیید کرد.

۲-سلولهای غیر اسپرمی Non Sperm cell: علاوه بر اسپرماتوزوئید، مایع منی دارای سلول‌های اپی‌تلیال ناحیه اوروژنیتال است که به آنهاRound cell نیز می‌گویند که شامل لکوسیت و سلول‌های اسپرماتوژنز می‌باشند.

*نکته: با یک ارزیابی اولیه میکروسکوپی می‌توان به آگلوتیناسیون و تجمع اسپرماتوزوئید و همچنین وجود سلول‌های اضافی، لکوسیت، ژرم سل و سلول‌های اپی‌تلیال و همچنین نیاز به رقت اضافی برای شمارش پی برد.

۳-آنالیز میکروسکوپی

بررسی حرکت اسپرم در فاصله ۶۰ دقیقه (۳۰ دقیقه بهتر است) انجام می‌شود. حرکت اسپرم را بر اساس معیار زیر طبقه بندی می‌کنیم:

  1. I) پیشرونده(PR-Progresive) : حرکت رو به جلو در میدان که یا خطی است و یا حرکت در طی یک قوس بزرگ انجام می‌شود.
  2. II) غیر پیشرونده (NP- Non Progresive): حرکت دور یک نقطه و یا حرکت دور یک دایره کوچک

III) غیر متحرک (Im- Immotile): بدون حرکت

حرکت پیشرونده را به حرکت پیشرونده تند و کند نیز تقسیم می‌کنند که نیاز به تکنسین ورزیده دارد. بر اساس پیشنهاد WHO هرگاه علاوه بر حرکت (moltility) سرعت یا (velocity) نیاز به بررسی داشته باشد، در حرارت ۳۷ درجه از سیستم‌های CASA استفاده می‌شود.

اسپرماتوزوئیدهای نرمال زیر میکروسکوپ حالت گرد دارند، بنابراین اسپـــــــرماتوزوئیدهای با سر سوزنی (Pin head) که ممکن است حرکت سریع نیز داشته باشند، به دلیل نداشتن ماده ژنتیکی غیر بارور بوده و نباید در شمارش اسپرم‌های متحرک به حساب آیند.

۴- شمارش اسپرماتوزوئید

شمارش اسپرماتوزوئیدها در یک مرد بارور نشانگر میزان سلامت بیضه‌ها و مجاری سازنده و خارج کننده اسپرم است. تعداد اسپرم در واحد حجم وابسته به میزان رقیق سازی اسپرماتوزوئیدهای ساخته شده در بیضه توسط ترشحات غدد وابسته از اپیدیدیم تا مجرای خارجی است، بنابراین از روی تعداد در واحد حجم نمی‌توان دقیقاً فعالیت بیضه‌ها و یا مجاری را به تنهایی پیش‌بینی کرد. با توجه به اینکه ترشح غدد وابسته در افراد متفاوت، مختلف است، بهتر است به جای گزارش تعداد اسپرم در واحد حجم، تعداد اسپرم در هر انزال را گزارش کرد. تعداد اسپرم در یک انزال وابسته به زمان جلوگیری و همچنین اندازه بیضه دارد.

هرگاه تعداد انزال در یک روز چند تا باشد، پس از هر انزال تعداد اسپرماتوزوئیدها در واحد حجم نسبت به قبل افزایش می‌یابد زیرا در هر انزال اپیدیدیم کاملاً خالی نمی‌شود، در حالی که ترشحات غدد وابسته خیلی کم می‌شود. مردانی که بیضه کوچک دارند، زمان پرهیز تقریباً اثری روی تعداد اسپرم در واحد حجم ندارد. هرچه بیضه بزرگتر باشد تغییرات چشمگیرتر است.

در مواردی که هدف بکارگیری روش‌های پیشرفته باروری (ART) است، اگر چند تا اسپرم مشاهده شد نیازی به شمارش دقیق آن نیست، ولی برای روش‌های جلوگیری از بارداری و وازکتومی شمارش دقیق اسپرم حتی در تعداد کم اهمیت دارد. آزوسپرمی(Azospermia) به حالتی گفته می‌شود که هیچگونه اسپرماتوزوئیدی در مایع وجود نداشته باشد، بنابراین برای اثبات آن بررسی رسوب سانتریفوژ شده اسپرم ضروری است.

 

۵- مرفولوژی اسپرم

بر اساس راهنمای WHO مرفولوژی اسپرماتوزوئید را می‌توان هم روی نمونه تازه و هم رنگ‌آمیزی شده ارزیابی کرد. در نمونه رنگ‌آمیزی شده اندازه اسپرم کمی کوچک‌تر از نمونه تازه دیده می‌شود و زوائد سیتوپلاسمیک حساس به شرایط اسمولالیته که اغلب در اسپرماتوزوئیدهای فعال دیده می‌شوند در رنگ‌آمیزی از بین می‌روند ولی باقیمانده‌های سیتوپلاسمی اضافی که در اسپرماتوزوئیدهای غیر فعال وجود دارند در رنگ‌آمیزی دیده می‌شوند. رنگ‌های پاپانیکولا، Sherr، Diffquik و متیلن بلو توسط WHO، پیشنهاد می‌گردند.

اسپرم

مرفولوژی نرمال یک اسپرماتوزوئید به شرح زیر است:

سر (Head): بیضوی نرمال. سرهای گرد، کشیده، دوتایی و آمورفوس(Amorphous) غیر طبیعی‌اند. اندازه سر ۶-۵ میکرومتر و آکروزوم ۵/۳-۵/۲ میکرومتر است که ۷۰-۴۰% سر را می‌تواند تشکیل دهد.

گردن یا (Mid-piece): گردن صاف است ولی کمی از دم ضخیم‌تر دیده می‌شود. ضخامت یک میکرومتر و طول ۵/۱ برابر سر است.

دم (Tail): دم یکی است و سالم و غیر شکسته و صاف و بدون هرگونه پیچ خوردگی و خمیدگی است و حدود ۴۵ میکرومتر می‌باشد. اسپرم طبیعی بر اساس معیارهای WHO دست‌کم باید دارای ۳۰% اسپرماتوزوئید نرمال باشد. بر اساس معیارهای Krugerو همکارانش هر اسپرماتوزوئیدی طبیعی به نظر نرسید، غیر طبیعی در نظر گرفته می‌شود. بر این اساس در اسپرم طبیعی باید بیش از ۱۵% اسپرماتوزوئیدها نرمال باشند. مرفولوژی نرمال ۱۴-۴% بینابین می‌باشد و کمتر از ۴% غیر طبیعی شناخته می‌شود.

شواهد نشان می‌دهد که تعداد اسپرماتوزوئیدها و مرفولوژی نرمال متناسب با قدرت باروری مرد هستند. شاید دلیل آن عدم حمل ماده ژنتیکی متناسب در اسپرماتوزوئیدهای با مرفولوژی غیر نرمال باشد، همچنین مشخص شده که اسپرماتوزوئیدهای با مرفولوژی غیر نرمال دارای حرکت مناسبی نیز نیستند. حرکت غیر طبیعی نیز در رسیدن اسپرماتوزوئید به تخمک و نفوذ در آن مؤثر است.

IVF (Invitro Fertilization ) در مواردی که مرفولوژی غیر طبیعی سبب ناباروری می‌شود کمک کننده است. هر دو معیار WHO و Kruger برای تشخیص فرد بارور از غیر بارور مفید هستند. برخی معتقدند که معیار Kruger برای پیشگویی موفقیت IVF بهتر عمل می‌کند زیرا بیشتر به مرفولوژی اسپرماتوزوئید تأکید دارد و آستانه معیارهای اسپرم بارور در آن خیلی سختگیرانه است.

 

اسپرموگرام کامپیوتری یا روش CASA (Computer assisted semen analysis)

CASA در واقع برای بهبود درستی روش دستی ابداع شد. هدف ارائه یک استاندارد غیر وابسته به فرد و با تکرار پذیری بالا برای شمارش ارزیابی حرکت و مرفولوژی اسپرم‌هاست. با این روش حرکت اسپرم با روشی به نامKinematic سنجیده می‌شود و بر اساس واژه‌های از پیش تعیین شده زیر بیان می‌شود. CASA نیاز به تجهیزاتی همانند میکروسکوپ فاز کنتراست، دوربین، دستگاه ضبط تصاویر، نمایشگر تصاویر، کامپیوتر، پرینتر و نرم‌افزار ویژه ارزیابی حرکت اسپرم و همچنین یک Chamber مخصوص که عمق ۱۰ میکرونی را برای حرکت اسپرم فراهم می‌کند، دارد. دوربین حرکت اسپرم را در فرم‌هایی از ۳۰ تا ۲۰۰ فرم در ثانیه ضبط و تبدیل به تصاویر دیجیتال می‌کند. نرم‌افزار تغییر موقعیت اسپرم را در هر فرم با دیگری مقایسه می‌کند. اسپرم‌های با حرکت فعال که مناسب برای رسیدن به تخمک هستند را در این روش به راحتی می‌توان تشخیص داد.

امروزه روش CASA به عنوان روشی استاندارد در آزمایشگاه‌های آندرولوژی معرفی می‌شود. در این روش شمارش اسپرماتوزوئید به دقت در حالت الیگوسپرمی و همچنین در تعداد اسپرماتوزوئید بالا اندازه‌گیری می شود.

ارزش پارامترهای ارائه شده توسط CASA نیز در برخی مطالعات بر اساس نفوذ اسپرم در موکوس سرویکال و اتصال به ناحیه زونا صحه گذاری شده است. تعریف پارامترهایCASA به صورت زیر است که در جدول ارائه گردیده است.

Veleocity of straight Line(VSL) سرعت حرکت مستقیم اسپرم؛ متوسط حرکت سر اسپرم در یک خط مستقیم از نقطه پایان اندازه‌گیری است.

Veleocity of Line Curved (VCL) سرعت سر اسپرم در مسیر واقعی طی شده را می‌گویند.

Veleocity of Averagepath (VAP) سرعت میانگین حرکت سر اسپرم

STR درصد مستقیم الخط بودن حرکت اسپرم Straightness = VSL/ VAP x 100

Linearity (LIN): درصد خطی بودن حرکت اسپرم‌ها VSL/VCL x 100

Lateral amplitude (ALH): دامنه نوسانات حرکت اسپرم‌ها

Beat Frequency (BCF): فرکانس نوسانات اسپرم‌ها

*نکته:CASA با اندازه‌گیری پارامترهای فوق و پردازش آنها حرکت اسپرماتوزوئیدها را در چهار گروه مورد تأیید WHO به صورت A، B، C و D قرار داده و گزارش می‌کند. در این روش تأثیر خطاهای فردی از بین رفته و آزمایش استاندارد و یکدست خواهد شد؛ بنابراین دانستن این پارامترها در ارزیابی‌های روتین ضروری نیست.

 

آنتی بادی ضد اسپرم Sperm antibodies

از آنجا که اسپرم بعد از بلوغ در مرد ساخته می‌شود، پروتئین‌هایش برای سیستم ایمنی بیگانه است. اسپرماتوزوئیدها در بیضه‌ها توسط اتصالات محکم بین سلول‌های سرتولی از آنتی‌بادی‌های سرم محافظت شده و از دید سیستم ایمنی نیز به دور هستند. اگر این سد خراب شود علیه اسپرماتوزوئیدها آنتی‌بادی ساخته می‌شود. از جمله عوامل شکستن این سد می‌توان وازکتومی، ترمیم واریکوسل، بیوپسی‌های بیضه، ضربه و عفونت‌ها را نام برد. آنتی‌بادی‌ها از طریق غدد ترشحی جانبی به ویژه غدد پروستات و غدد سمینال به داخل مایع منی ریخته می‌شوند. آنتی‌بادی‌ها سبب چسبندگی اسپرماتوزوئیدها می‌شوند. تماس جنسی یا استفاده از روش‌های باروری مصنوعی در زنان سبب ایجاد آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم نمی‌شود، ولی ضربه و یا تماس اسپرم با مخاطی غیر از واژن در خانم‌ها سبب ایجاد آنتی‌بادی ضد اسپرم می‌شود. دو تست زیر مهم‌ترین روش‌های شناسایی آنتی‌بادی ضد اسپرم است:

 

راکسیون آگلوتیناسیون مخلوط The Mixed Agglutination Reaction (MLR )

در این روش اسپرماتوزوئیدها را با ذرات لاتکس یا RBCهای پوشیده شده از آنتی‌بادی‌ها بر علیه نوع IgG یا IgA مخلوط می‌کنیم. در صورت وجود آنتی‌بادی بر سطح اسپرماتوزوئید به آنتی آنتی‌بادی‌های متصل شده در زیر میکروسکوپ تجمع اسپیرماتوزوئید و ذرات لاتکس را می‌بینیم. اگر تست منفی باشد اسپرماتوزوئیدهای فعال دیده خواهند شد. بر اساس معیار WHO آگلوتیناسیون بیش از ۵۰% اسپرماتوزوئیدها در این تست ارزش کلینیکی دارد.

 

تست چسبندگی به ایمونوبیدThe Immunobead Binding Test

این روش همانند روش قبلی است با این تفاوت که اسپرم‌ها را قبلاً برای از بین بردن پروتئین‌های مداخله‌گر شستشو می‌دهیم. اتصال بیدها را زیر میکروسکوپ بررسی می‌کنیم. اطلاعات به دست آمده در این روش بیشتر است زیرا مقدار اسپرم‌های درگیر و همچنین محل اتصال بیدها را روی سر یا دم نیز می‌توان بررسی کرد. اگر آنتی‌بادی روی اسپرم نباشد ذرات بید نیز چسبندگی ندارند. از این روش همچنین می‌توان برای ارزیابی آنتی‌بادی‌ها در سرم مرد (علاوه بر آنتی‌بادی‌های مایع منی) و همچنین سرم مایع فولیکولار و سرویکال خانم‌ها با انکوباسیون اسپرم‌ها با این مایعات نیز مورد بررسی قرار داد، بنابراین ابتدا اسپرماتوزوئیدها شسته می‌شوند سپس با این مایعات انکوبه می‌شوند و پس از شستشوی دوباره بیدها را اضافه می‌کنند و زیر میکروسکوپ می‌بینند.

بر اساس معیار WHO چسبندگی بیدها بیش از ۵۰% ارزش کلینیکی دارد. مشخص گردیده آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم سبب اختلال در حرکت و ناباروری می‌شود. با وجود ۵۰ تا ۸۰% آنتی‌بادی‌ها روی اسپرم روش‌های IVF و IUI کمک کننده است. در موارد بیش از ۸۰% روش‌های ICSI مفید است.

 

تست زنده بودن اسپرم یاSperm Vitality

هرگاه تعداد اسپرم‌های بی‌حرکت زیاد بود برای شناخت اسپرماتوزوئیدهای زنده از مرده که در روش‌های ICSI به کار می‌آیند، مفید است. از رنگ‌آمیزی حیاتی مثل ائوزین یا فلوسیتومتری نیز می‌توان استفاده کرد.

 

بررسی آکروزوم اسپرمAssays of The Sperm Acrosome

اکروزوم یک ارگانل داخل سلولی است (شبیه لیزوزوم) که شبیه یک سرپوش بر روی هسته قرار می‌گیرد. آکروزوم حاوی تعداد زیادی آنزیم‌های هیدرولیتیک همانند هیالورونیداز، نورامیداز، پروآکروزین، فسفولیپاز و اسید فسفاتاز می‌باشد که پس از رها سازی به نفوذ اسپرم به لایه کمک می‌کند. بررسی‌های با میکروسکوپ الکترونیک و همچنین رنگ‌آمیزی آکروزوم و آنتی‌بادی‌های کنژوگه با مواد فلورسنت و مطالعه زیر میکروسکوپ فلورسنت نیز اطلاعاتی مفید در مورد عملکرد آکروزوم به ما می‌دهد.

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

دکتر علیرضا پوررضا (DCLS)

آزمایشگاه تشخیص طبی دانش

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی