معماری
ویتامین d

روش‌های اندازه‌گیری ویتامین D

روش‌های اندازه‌گیری ویتامین D

در چند سال اخیر درخواست جهت سنجش ویتامین D افزایش یافته است؛ علت این افزایش انتشار تحقیقاتی است که بیانگر نقش حفاظتی ویتامین D در برابر بیماری‌های اسکلتی و غیراسکلتی همچون سرطان است. اخیراً یک گزارش مورد توافق در خصوص محدوده مرجع و نیز میزان مصرف روزانه این ویتامین منتشر شده است. بطور کلی دو گروه روش برای اندازه‌گیری ویتامین D وجود دارد اما حساسیت متفاوت این روش‌ها به اشکال مختلف متابولیت این ویتامین باعث ایجاد سردرگمی در تفسیر نتیجه شده است. در این مقاله ۲۵- هیدروکسی ویتامین D توتال به عنوان آزمایش اصلی جهت بررسی ویتامین D توصیه شده و روش‌های مختلف را با هم مقایسه می‌کند.

سنجش ویتامین D در گذشته مشکوک و مبهم تلقی می‌شد اما اخیراً به یکی از پرگفتگوترین آزمایش‌های بیوشیمی تبدیل شده است. بنا بر اظهار کلینیک مایو۱، مقدار توصیه شده ویتامین D جهت کاهش بیماری‌های قلبی عروقی و سرطان کولون روزانه IU 1000 بصورت خوراکی می‌باشد. اهمیت این مصرف در فصل سرد که تابش نور کمتر است بیشتر می‌شود، البته برای درمان پوکی استخوان دوزهای بالاتری لازم است. گزارش سال ۲۰۱۰ مؤسسه طب (IOM)2 تصریح می‌کند که برای افرادکمتر از ۷۰ ســــــال روزانه IU 600 ویتامین D باید از طریق غذا مصرف گردد و حداکثر این مصرف روزانه IU 4000 است.

 

ویتامین d

اهمیت بالینی

از نظر تاریخی نقش ویتامین D تحکیم دندان و استخوان از طریق تنظیم هموستاز کلسیم و فسفر بوده است. مطالعات اخیر نقش‌های دیگری همچون کاهش ابتلا به سرطان۳، بیماری‌های قلبی و عروقی و دیابت را نیز برای این ویتامین قائل شده‌اند. بیش از ۲۰۰۰ ژن در بدن انسان به ویتامین D حساس هستند۵، لذا ابتلا به بیماری‌های استخوانی و غیراستخوانی۴ می‌تواند نسبت به نوسان این ویتامین حساس باشد. بازتعریف مقدار کافی ویتامین D برای انسان ممکن است افراد بیشتری را در محدوده کمبود این ویتامین قرار داده و نیاز به درمان با آن را افزایش دهد۶.

ارتباط سطح خونی ویتامین D با بیماری‌های پیش‌گفت کاملاً روشن نیست، بنابراین استاندارد کردن روش‌های سنجش این ویتامین و بازتعریف محدوده طبیعی آن نهایت اهمیت را دارد.

در دهه‌های اخیر مقادیر کمتر از ng/ml 10 ویتامین D توتال (۲۵- هیدروکسی) ناکافی و مقادیر بین ۳۰ تا ۱۰۰ نانوگرم در میلی‌لیتر بسنده تلقی شده است. درمورد ۱ و ۲۵– دی هیدروکسی ویتامین D محدوده کفایت بین ۱۶ و ۵۶ نانوگرم در میلی‌لیتر بوده است و مقادیر بالاتر از ۱۰۰ نانوگرم در میلی لیتر، سمی تلقی شده است۷. بر اساس برآورد غیررسمی که CAP در سال ۲۰۰۹ با جمع‌آوری اطلاعات از آزمایشگاه‌های مختلف منتشر کرد۸ تلقی واحدی از محدوده مرجع این ویتامین وجود ندارد، همچنین بسیاری از پزشکان معتقدند که همزمان با ویتامین D باید میزان PTH هم سنجیده شود تا بتوان تصمیم درمانی گرفت۸.

در سال ۲۰۱۰ راهکار جدید انجمن طب IOM))9 مقدار کافی ویتامین D را بین ۲۰ تا ۵۰ نانوگرم در میلی‌لیتر اعلام کرد و مقادیر بالای ۵۰ را سمی توصیف نمود. شواهد نشان می‌دهد که ۲۵- هیدروکسی ویتامین D توتال مهم‌ترین فرم به جهت بالینی می‌باشد۱۰و۱۱. روش‌های مورد استفاده در آزمایشگاه‌های روتین باید قادر به سنجش این فرم ویتامین باشند و اطلاعات را بطور شفاف به پزشک منتقل کنند.

 

پس‌زمینه

ویتامین D یک هورمون استروئیدی است که جهت فعال شدن در بدن انسان باید مراحل متابولیک متعددی را طی کند. ویتامین D در منابع مختلف همچون تخم‌مرغ و ماهی و به اشکال مختلف چون ویتامین D2 یا ۲۵- هیدروکسی ویتامین D2 (ارگوکلسیفرول ) و ۲۵- هیدروکسی ویتامین D3 (کوله‌کلسیفرول) یافت می‌شود. کوله‌کلسیفرول در پوست در مقابل تابش اشعه فرابنفش از ۷- دهیدروکلسترول ایجاد می‌شود. هر دو فرم ویتامین D به مقدار جزئی در غذاها و بافت‌های بیولوژیک وجود دارند و همچنین بصورت مکمل‌های دارویی در دسترس می‌باشند.

۲۵- هیدروکسی ویتامین D در کلیه به فرم فعال خود یعنی ۱ و ۲۵– دی هیدروکسی ویتامین D تبدیل می‌شود. این فرآورده هم به نوبه خود به محصولاتی تبدیل می‌شود که در بافت‌ها قابل اندازه‌گیری هستند. توزیع بافتی متابولیت‌های ویتامین D به لحاظ مشکلات سنجش چندان مشخص نیست۱۲.

تبدیل ویتامین D به اشکال غیرفعال عمدتاً از طریق واکنش‌های اکسیداتیو انجام شده و ترکیبات مختلفی را ایجاد می‌کند، مع‌الوصف بر طبق یافته‌های IOM و سایر مجامع ذیصلاح، تنها ۲۵-هیدروکسی ویتامین D و ۱و ۲۵– دی هیدروکسی ویتامین D اهمیت بالینی دارند و برای مقاصد درمانی ۲۵-هیدروکسی ویتامین D توتال حائز اهمیت است۲و۱۰و۱۱. یک ویتامین دیگر موسوم به ۲۵- هیدروکــــسی ویتامـــین D3 اپی‌مر (C-3epimer) ابتدا در کودکان زیر یک سال کشف شد۱۳ اما بعدها در پلاسمای بزرگسالان هم یافت گردید۱۴. فرم اخیر با روش‌های گوناگون سنجــیده شــده اما بـــــــــــــــــــــــطور خــــــــاص با روش (LC-ms/ms)15 Liquid Chromatography-mass Spectrometry اندازه‌گیری می‌گردد. واضح است که عنوان ویتامین D بسته به روش کار گرفته شده به محصولات گوناگونی اطلاق می‌شود.

 

روش‌های اندازه‌گیری ویتامین D

از نظر تاریخی سنجش ویتامین D به کمک روش‌های اتصال رقابتی، HPLC و RIA بوده است. کیت RIA شرکت Diasorin بسیار معمول بود و توسط بسیاری از آزمایشگاه‌های مرجع مورد استفاده واقع می‌شد و در واقع استاندارد طلایی سنجش ویتامین D محسوب می‌گردید۷و۱۶. از این کیت جهت تعیین محدوده مرجع در دهه گذشته استفاده می‌شد۷. کیت سنجش ۲۵- هیدروکسی ویتامین D مربوط به شرکت Diasorin یک روش دو مرحله‌ای را پی می‌گیرد؛ در مرحله اول استخراج سریع ۲۵- هیدروکسی ویتامین D و سایر متابولیت‌های هیدروکسیله آن از سرم یا پلاسما انجام می‌شود و سپس با استفاده از یک آنتی‌بادی اختصاصی علیه ۲۵- هیدروکسی ویتامین D روش RIA رقابتی دنبال می‌گردد.

روش مرجع جهت سنجش ویتامین D روش LC-MS/MS است که ویتامین D2، D3 و D3 epimer را به طور جداگانه اندازه‌گیری نموده و جمع آنها را به عنوان ویتامین D توتال گزارش می‌کند۷٫.

این روش توسط آزمایشگاه مواد غذایی در (CDC) و همچنین آزمایشگاه ملی در انگلستان جهت سنجش ویتامین D در بررسی‌های مربوط به سلامت و تغذیه بکار گرفته می‌شود. توانایی این روش در اندازه‌گیری هر سه فرم ویتامین D که در سنین مختلف وجود دارند مزیتی جهت انتخاب آن محسوب می‌گردد۱۷و۱۸و۱۹. این روش بسیار کاربر و از نظر فنی پیچیده است.

روش HPLC می‌تواند ۲۵- هیدروکسی ویتامین D2 و D3 را اندازه بگیرد. روش HPLC به شکل کیت توسط کمپانی‌های هیتاچی و Fisher Scientific عرضه شده است. در این کیت‌ها سنجش ویتامین D کم‌زحمت‌تر و مقرون به صرفه‌تر خواهد بود.

روش‌های کروماتوگرافی جدیدتری جهت ارتقاء حساسیت، ساده کردن مراحل انجام و سنجش همه اشکال متابولیت‌های ویتامین D عرضه شده است؛ بعنوان مثال در روش LC-MS/MS همه اشکال ویتامین D شامل ویتامین D2، D3 و ۲۵- هیدروکسی ویتامین D بطور همزمان در سرم اندازه‌گیری می‌شود. در این روند از یک روش آشکارسازی یونیزاسیون بنام (APPI) Atmospheric Pressure Photo Innization جهت افزایش حساسیت استفاده شده است. در مقایسه با سایر روش‌های LC که مستلزم مرحله تغلیظ می‌باشند این روش ساده‌تر است۱۲.

روش‌های LC-MS می‌توانند ویتامین D2 و D3 را از هم جدا کرده و اندازه‌گیری نمایند اما بیشتر روش‌های ایمونواسی قادر به این کار نیستند. برحسب میزان ویژگی آنتی‌بادی در روش ایمونواسی برخی از روش‌های ایمونواسی تنها یک فرم ویتامین D را اندازه می‌گیرند. کیت Diasorin هر دو فرم را بطور یکسان اندازه می‌گیرد و بقیه کیت‌ها در سنجش D2 و D3 مقادیر مختلفی واکنش متقاطع دارند.

 

روش‌های ایمونواسی

روش‌های ایمونواسی متعددی وجود دارند که تأییدیه FDA را هم کسب نموده‌اند، از جمله این روش‌ها کمیلومینه‌سانت (CLIA) می‌باشد. کمپانی Diasorin که قبلاً روش RIA را عرضه کرده بود روش CLIA را هم برای دستگاه LIAISON ارائه نموده است. این روش که در سال ۲۰۰۲ معرفی شد ۲۵- هیدروکسی ویتامین D توتال و سایر متابولیت‌های هیدروکسیله این ویتامین را در سرم اندازه‌گیری می‌کند.‌ در مرحله اول ۲۵- هیدروکسی ویتامین D از پروتئین‌های متصل به آن جدا می‌شود و به آنتی‌بادی متصل به سطح جامد وصل می‌گردد، سپس ردیاب (Tracer) vitamin D -isoluminolاضافه شده و موادی که به سطح جامد متصل نشده باشند با شستشو از محیط خارج می‌گردند. در مرحله بعد معرف جهت شروع واکنش کمیلومینه‌سانت اضافه می‌شود. اشعه ساطع شده توسط یک فتومالتی‌پلایر اندازه‌گیری می‌شود که بطور معکوس با غلظت ۲۵-هیدروکسی ویتامین D تناسب دارد۲۱. بررسی مهارت‌سنجی که در سال ۲۰۰۹ در امریکا بعمل آمد نشان می‌دهد که بیش از یک سوم آزمایش‌هایی که در این برنامه شرکت کرده بودند ویتامین D را با روش دیامورین-لیاسون اندازه گرفته‌اند۲۲.

کمپانی Abbott هم روش تمام اتوماتیک سنجش ۲۵- هیدروکسی ویتامین D را برای دستگاه ARCHITECT عرضه کرده است. روش بکار رفته (CMIA) delayed chemiluminescentmicroparticle immunoassay و یک مرحله‌ای می‌باشد۲۳. این روش هم تأییدیه FDA را در سال ۲۰۱۱ دریافت کرده است۲۴.

کمپانی Immuno Diagnostic هم یک روش ایمونواسی CMIA برای سنجش ۲۵- هیدروکسی ویتامین D توتال و سایر متابولیت‌های هیدروکسیله آن در سرم یا پلاسمای انسان عرضه نموده است. این روش دارای ویژگی یکسان جهت ۲۵- هیدروکسی ویتامین D2 و D3 بوده و حساسیت آن ۵/۵ نانوگرم در میلی‌لیتر است۲۵.

روش الکتروکمیلومینه‌سانس ECL هم توسط شرکت Roche جهت سنجش ۲۵- هیدروکسی ویتامین D عرضه شده که بر روی تمام پلتفرم‌های کوباس قابل استفاده است. این روش تأئیدیه FDA را در سال ۲۰۱۲ دریافت نمود۲۶.

روش‌های آنزیم ایمونواسی هم وجود دارند. از جمله شرکت Dazyme Laboratiries روشی عرضه کرده که از پروتئین هموژن وصل شونده به ویتامین D که به آنزیم متصل است برای سنجش ۲۵- هیدروکسی ویتامین D توتال (شامل D2 و D3) استفاده می‌کند. این پروتئین ویتامین D2 و D3 را بطور مساوی شناسایی می‌کند و همچنین مقدار واقعی ۲۵- هیدروکسی ویتامین D را می‌سنجد۲۷.

روش ایمونواسی دیگری توسط شرکت زیمنس برای دستگاه ADVIA Centaur طراحی شده که با روش ایمونواسی رقابتی هموژن به اندازه‌گیری ویتامین D می‌پردازد۲۸.

مقالات زیادی به مقایسه روش‌های RIA و HPLC14 و سایر روش‌های ایمونواسی و HPLC29و۳۰و۳۱و۳۲و۳۳و۳۴ پرداخته‌اند که در مقالات جدیدتر۸ توافق بهتری بین روش‌های ایمونواسی و LC-MS/MS مشاهده می‌شود.

 

نتایج

بررسی‌های مهارت‌آزمایی CAP در سال ۲۰۰۹ و ۲۰۱۰ نشان می‌دهد۱۵و۳۴ که بیشتر روش‌های متداول سنجش ویتامین D دارای مقادیر مطلق، خطی بودن و دقت مشابهی هستند. اما یک بررسی کنترل کیفی خارجی۳۵ در انگلستان که اخیراً بعمل آمده نشان می‌دهد که سنجش کمی ویتامین D توسط روش‌های HPLC، LC-MS و Diasorin مقدور است۸و۳۵.

روش‌های کروماتوگرافی دارای ویژگی بیشتری بوده اما بخاطر داشتن مراحل متعدد از نظر عملی جذابیت ندارند. روش‌های HPLC و LC-MS/MS گرچه نیازمند تجهیزات گرانقیمت‌تری هستند اما از نظر مصرف معرف‌ها ارزا‌ن‌تر هستند. روش‌هایی جهت نیمه اتوماتیک یا اتوماتیک کردن HPLC و LC-MS/MS وجود دارد اما در مقایسه با ایمونواسی بسیار وقت‌گیرتر می‌باشند۸. در بیشتر روش‌های HPLC و LC-MS/MS از استاندارد داخلی استفاده می‌شود که ممکن است در مقایسه با روش‌های ایمونواسی یک بایاس مثبت ایجاد کند. در مجموع دقت روش‌های ایمونواسی، HPLC و LC-MS/MS مشابه بوده و همگی حساسیت لازم برای تشخیص کاهش شدید ویتامین D را دارند۳۰.

به نظر می‌رسد که روش‌های LC-MS/MS بایاس مثبت و روش LIASON Diasorin اندکی بایاس منفی دارند، لذا با روش دیامورین در مقایسه با روش LC-MS/MS ممکن است برخی بیماران بعنوان مبتلا به فقر ویتامین D شناخته شوند۳۱.

در مطالعه اخیر۳۲ بین ۵ روش ایمــونواسی اتوماتیک (Abbott ARCHITECT، LIASON Diasorin، IDS i-SYS، Roche و Simens ADVIA Centaur) یک روش RIA (دیاســـــــــورین) و دو روش LC-MS/MS مقایسه بعمل آمده است. روش‌های اتوماتیک ایمونواسی تفاوت‌هایی داشتند اما روش‌های LC-MS/MS با هم منطبق بودند. نتایج روش RIA با اندکی بایاس مثبت مشابه LC-MS/MS بود. تمام روش‌های ایمونواسی مذکور میزان ۲۵- هیدروکسی ویتامین D را اندازه می‌گیرند به جز روش Roche که تنها میزان ویتامین D3 را می‌سنجد. متوسط بایاس مثبت در روش Abbott بالاتر از بقیه بود. متد Roche بایاس مثیت کمی نشان داد. بیشتر روش‌ها دقت خوبی را در Intra & Interassay با CV کمتر از ۱۰% نشان دادند. بررسی مهارت‌سنجی اخیر CAP نشان می‌دهد که عدم صحت و بایاس منفی در سنجش‌های Siemens ADVIA بیشتر از دستگاه‌های Abbott و LIASON است۱۵.

Holmes و همکارانش۳۳ نتایج سنجش میزان ۲۵- هیدروکسی ویتامین D را با دستگـــاه‌هایARCHITECT Abbott و Centaur0 Siemens ADVIAو نتایج حاصـــــــــل از LC-MS/MS مقایسه کردند. هر دو روش ایمونواسی دارای بایاس مثبت بودند که موجب تخمین بیش از اندازه فقر ویتامین D و در نتیجه درمان بی‌مورد می‌گردند.

 

بحث

مقایسه‌های اولیه بین روش‌های HPLC و ایمونواسی در سنجش ویتامین D اختلافات قابل توجهی نشان می‌دادند که بنا بر عدم صحت روش‌های ایمونواسی در مقایسه با روش‌های مرجع بود، اما با ارتقاء روش‌ها انطباق بهتری در میان نتایج با روش‌های مختلف به دست آمده است۸. یک مطالعه در سال ۲۹۲۰۰۵ حاکی از توافق خوب بین نتایج حاصل از Diasorin LIASON با روش LC-MS/MS بوده است.

 

نتیجه

روش‌های ایمونواسی جهت سنجش ویتامین D توتال وجود دارند که با توجه به نیاز بازار دقت و صحت خود را بهبود بخشیده‌اند. این روش‌ها با سیستم‌های اتوماتیک هماهنگ بوده و لذا زمان انجام تست را کاهش داده‌اند و برخلاف روش‌های کروماتوگرافی نیازمند افراد خبره برای انجام آزمایش نیستند. بر اساس بررسی مهارت‌سنجی سال ۲۰۰۹ روش‌های Diasorin LIASON و ARCHITECT Abbott دقت و صحت و کارایی لازم را در سنجش ویتامین D دارند۳۴، اما در بررسی سال ۲۰۱۲ از میزان صحت این روش‌ها کاسته شده و IDS i-SYS صحت بیشتری داشته است۱۵.

تعداد روزافزونی از بیماران به استفاده از مکمل‌های ویتامین D یا حتی دوزهای درمانی بالاتر جهت درمان یا کاهش ریسک ابتلا به بیماری‌های استخوانی، سرطان و قلبی عروقی توصیه می‌شوند. اما IOM2 در گزارش سال ۲۰۱۰ خود میزان مجاز مصرف روزانه ویتامین D را IU600 در روز اعلام نموده و ثابت کرده که مسمومیت با ویتامین D کمتر از آنی است که قبلاً تصور می‌شده است، لذا جهت پیشگیری از عدم درمان یا درمان غیرضروری نیاز به روش‌های دقیق سنجش این ویتامین محسوس است. با توجه به اسامی متعدد ویتامین D و مشتقات آن برای پزشکان و کادر درمانی ممکن است ایجاد ابهام گردد. این ابهام به جهت اینکه آزمایشگاه‌ها هم از اسامی متعددی در برگه جواب جهت ویتامین D استفاده می‌کنند، افزون می‌گردد. بنابراین لازم است که آزمایشگاه‌ها بتوانند پزشکان را در ارائه درخواست تفسیر آزمایش‌های ویتامین D یاری نمایند.

ماهنامه اخبارآزمایشگاهی

دکتر حمید زارع

این مقاله ترجمه‌ای است از :

Current Methods for Routine Laboratory Testing of Vitamin D Levels

  • Wendy L Arneson, MS, MLS(ASCP)CM , and Dean L Arneson, PharmD, PhD

Lab Medicine Winter 2013 | Volume 44, Number 1