معماری

آزمایش های تشخیص باکتری های دارای بتالاکتاماز با دامنه گسترده (ESBL)، متالوبتالاکتاماز(MBL) و پمپ های ایفلاکس

بتالاکتام ها دسته ای از آنتی بیوتیک ها هستند که از ساخت پپتیدوگلیکان جلوگیری می کنند. آنزیم های درگیر در ساخت پپتیدوگلیکان عبارتند از گلیکوزیل ترنسفراز(در تشکیل زنجیره خطی گلیکان)،‌ ترنس گلیکولازها (واکنش جانبی زنجیره های گلیکان با هم)، ترنس پپتیداز (واکنش بین اسیدهای آمینه زنجیره جانبی) و کربوکسی پپتیداز (جداکردن آخرین آلانین از زنجیره پنتاپپتیدی).
هدف آنتی بیوتیک های بتالاکتام، آنزیم های ترنس پپتیداز، ترنس گلیکولاز و کربوکسی پپتیداز هستند. این دسته آنتی بیوتیک ها از خانواده پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها و کرباپنم ها تشکیل شده اند.

باکتری ها یا به صورت ذاتی به آنتی بیوتیک ها مقاومند یا اینکه می توانند این مقاومت را کسب کنند. مکانیسم های مقاومت به آنتی بیوتیک ها در شکل ۲ خلاصه شده است. این مکانیسم ها به ۵ دسته تقسیم می گردند.
۱- غیر فعال نمودن آنزیمی آنتی بیوتیک                         ۲- کاهش نفوذپذیری باکتری نسبت به آنتی بیوتیک
۳- تغییر شکل گیرنده آنتی بیوتیک                              ۴- فعال شدن پمپ برون ده (ایفلاکس) آنتی بیوتیک
۵- استفاده از مسیر های فرعی متابولیسم

۱- آنزیم هایی که آنتی بیوتیک را تجزیه می کنند یا اینکه ساختار آنرا تغییر می دهند. از این دسته می توان آنزیم های بتالاکتاماز را مثال زد که حلقه بتالاکتام آنتی بیوتیک های دسته پنی سیلین و سفالوسپورین را تجزبه می کند (شکل ۳). در بسیاری از باکتری ها، آنزیم های بتالاکتاماز کروموزومی و یا پلاسمیدی وجود دارند. این آنزیم ها حلقه بتا لاکتام را هیدرولیز و در نتیجه آنتی بیوتیک را بی اثر می کنند.

۲- کاهش نفوذپذیری باکتری نسبت به آنتی بیوتیک.
۳- موتاسیون یا تغییر در پروتئین های هدف که باعث می شود به وسیله آنتی بیوتیک ها شناسایی نگردند. مانند تغییر در ریبوزوم ها (مثل متیله شدن) که از اتصال آنتی بیوتیک به آن جلوگیری می کند.
۴- پمپ های برون ده که باعث برون دهی آنتی بیوتیک به خارج باکتری می گردند. مانند مقاومت به تتراسایکلین
۵- مقاومت به آنتی متابولیت ها به وسیله تولید بیش از نیاز آن متابولیت یا تولید آن از طریق مسیر های جانبی. مانند مقاومت به تری متوپریم
طبقه بندی بتالاکتامازها:
آنزیم های بتالاکتاماز دارای انواع گوناگونی اند که کارایی آنها نیز در شکستن آنتی بیوتیک های بتالاکتام متفاوت است. دو روش مختلف برای طبقه بندی آنزیم های بتالاکتاماز استفاده می شود. این روش ها با نام Ambler و.Bush – Medeiros – Jacoby نامید می شوند. در روش Ambler آنزیم ها براساس تطابق و شباهت های سکانسی به چهار کلاس طبقه بندی می شوند. در این روش، کلاس های A، C وD سرین پروتئاز و کلاس B متالوبتالاکتاماز اند (کادر ۱). در روش بوش،‌ بتالاکتامازها بر اساس مشابهت های کارکردی طبقه بندی می شوند. در این متد چهار طبقه و چندین زیر طبقه قرار دارد.
در بین بتالاکتامازها دو نوع آنزیم به نام بتالاکتامازهای با دامنه گسترده (Extended Spectrum β Lactamase) و متالوبتالاکتاماز (Metallo beta Lactamase) اهمیت فراوانی دارند.
بتالاکتامازهای با دامنه گسترده آنزیم هایی هستند که توانایی تجزیه سفالوسپورین های با دامنه گسترده دارای زنجیره جانبی اکسی ایمینو مانند سفوتاکسیم‏‏، سفتریاکسون و سفتازیدیم و نیز اکسی ایمینو مونوبکتام مانند آزترونام را دارند به وسیله مهار کننده های بتالاکتاماز مانند کلاولانیک اسید مهار می شوند.
باکتری های دارای متالوبتالاکتاماز افزون بر توانایی تجزیه سفالوسپورین های نسل سوم و چهارم، متالوبتالاکتام ها یا     ایمی پنم ها را نیز تجزیه می کند. در این دسته کوانزیم Zn برای کارکرد آنزیم ضروری است. با اضافه نمودن ترکیب EDTA که باعث برداشته شدن این فلز از محیط کشت می گردد این آنزیم مهار می گردد.
کادر ۱- طبقه بندی آنزیم های بتالاکتاماز
Functional Classification
Group 1
CEPHALOSPORINASE, Molecular Class C (not inhibited by clavulanic acid)
Group 1 are cephalosporinases not inhibited by clavulanic acid, belonging to the molecular class C
Group 2
Group 2 are penicillinases, cephalosporinases, or both inhibited by clavulanic acid, corresponding to the molecular classes A and D reflecting the original TEM and SHV genes. However, because of the increasing number of TEM- and SHV-derived β-lactamases, they were divided into two subclasses, 2a and 2b.
Group 3
METALLOENZYME, Molecular Class B (not inhibited by clavulanic acid)
Group 3 are the zinc-based or metallo {beta}-lactamases, corresponding to the molecular class B, which are the only enzymes acting by the metal ion zinc, as discussed above. Metallo B-lactamases are able to hydrolyse penicillins, cephalosporins, and carbapenems. Thus, carbapenems are inhibited by both group 2f (serine-based mechanism) and group 3 (zinc-based mechanism)
Group 4
PENICILLINASE, No Molecular Class (not inhibited by clavulanic acid)
Group 4 are penicillinases that are not inhibited by clavulanic acid, and they do not yet have a corresponding molecular class.

بررسی ESBL:
الف- کشت: مانند جلسه سنجش حساسیت به آنتی بیوتیک ها از باکتری مورد نظر غلظت معادل ۰٫۵ مک فارلند تهیه و به وسیله سواب روی محیط مولر هینتون آگار کشت داده می شود.
ب-دیسک گذاری: در این روش از دیسک های ترکیبی استفاده می گردد. بدین معنی که از دو دیسک برای بدست آوردن نتیجه استفاده می گردد. بدین ترتیب دیسک های سفتازیدیم، سفپودوکسیم، سفوتاکسیم و دیسک هایی که هم دارای آنتی بیوتیک های فوق هستند و هم مهارکننده بتالاکتاماز (کلاولانیک اسید) در آنها موجود است، با فاصله حداقل ۳۰ میلی متر از یکدیگر روی پلیت گذاشته می شود.
ج- انکوباسیون: ۱۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد
د- نتایج و تفسیر: پس از انکوباسیون ‌قطر هاله نبود رشد پیرامون دیسک ها به وسیله خط کش یا کولیس بر حسب میلی متر اندازه گیری می شود. در صورتی که قطر هاله اطراف دیسک دارای آنتی بیوتیک و مهارکننده به میزان مساوی و یا بیش از ۵ میلی متر نسبت به قطر پیرامون دیسک آنتی بیوتیک به تنهایی افزایش یابد نشان دهنده وجود ESBL است

بررسی متالوبتالاکتاماز:
الف- کشت: مانند روشی که در بالا توضیح داده شده است.
ب- دیسک گذاری: در این روش نیز مشابه روش ESBL از دیسک ترکیبی استفاده می شود با این تفاوت که به جای مهار کننده بتالاکتاماز (کلاولانیک اسید) از ترکیب EDTA در داخل دیسک استفاده می گردد. بدین ترتیب در یک دیسک آنتی بیوتیک به تنهایی و دیسک دیگر همان آنتی بیوتیک و EDTA وجود دارد.
ج- انکوباسیون: ۱۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد
د- نتایج و تفسیر: پس از انکوباسیون، قطر هاله نبود رشد در پیرامون دو دیسک به وسیله خط کش یا کولیس بر حسب میلی متر اندازه گیری می شود. در صورتی که اندازه قطر هاله پیرامون دیسک ایمی پنم/EDTA  نسبت به دیسک ایمی پنم به تنهایی مساوی یا بیشتر از ۷ میلی متر افزایش داشته باشد، نشانگر وجود آنزیم متالوبتالاکتاماز در ایزوله مورد آزمایش است
سینرژیسم: سینرژیسم پدیده ای است که در درمان های ترکیبی (combination therapy) دیده می شود. درمان ترکیبی در موارد زیر انجام می گردد.
۱-    زمانیکه عفونت چند میکروبی است. مانند درمان عفونت های ناشی از سوراخ شدن روده یا عفونت آبسه دندانی
۲-    در مواردیکه نیاز است سریعا باکتری کشته شود یعنی فعالیت باکتریسیدالی نیاز باشد. مانند درمان عفونت انتروکوکوسی.
۳-    کاهش دادن خطر یا شانس ایجاد مقاومت. مانند درمان سل که عامل آن مایکوباکتریوم توبرکولوزیس است.
در این موارد باید درمان به صورت ترکیبی استفاده گردد و زمانیکه دو یا چند آنتی بیوتیک به صورت همزمان مصرف می گردند دارای بر همکنش های زیر می باشند.
الف- سینرژیسم: فعالیت ضد میکروبی دو آنتی بیوتیک بیشتر از هر یک از آنها به تنهایی می باشد.
ب- بدون تفاوت (Indifference): فعالیت ضد میکروبی آنها در هر دو شرایط ترکیبی و تکی یکسان است.
ج- آنتاگونیسم: فعالیت ضد میکروبی آنها زمانیکه به صورت ترکیبی استفاده می گردند کمتر از شرایط تکی است.
آنتی بیوتیک های زیر دارای اثر سینرژیسم می باشند
الف- تری متوپریم و سولفانامید ها
ب- بتالاکتام ها و آمینوگلیکوزید ها
ج- دالفوپریستین و کوئینوپریستین

پمپ های ایفلاکس: ایفلاکس فرایندی است که طی آن باکتری ترکیبات خارج سلولی سمی (داروها، مواد شیمیایی و…) را به خارج سلول دفع می نماید. بدین ترتیب از ایجاد غلظت مناسب مواد سمی و آنتی بیوتیک های جلوگیری می نماید. ایفلاکس آنتی بیوتیکی برای اولین بار در سال ۱۹۷۸ توسط لوی در اشریشیا کولی شناسایی شد و اکنون بیش از ۵۰ سیستم ایفلاکس دارویی شناسایی شده است. این پروتئین ها، در باکتری های گرم مثبت، گرم منفی و همینطور در ارگانیسم های یوکاریوت وجود دارند. پمپ های ایفلاکس ممکن است برای یک سوبسترا اختصاصی باشند یا اینکه طیف وسیعی از ترکیبات ساختاری متفاوت را انتقال دهند. بعضی از پمپ ها می توانند به مقاومت به چند دارو مرتبط باشند. میزان مقاومتی که توسط ایفلاکس پمپ ها ایجاد می شود بستگی به ماهیت میکروارگانیسم و سوبسترای آنتی بیوتیک دارد. از نظر بالینی مقاومت های معنی داری در بعضی از پاتوزن های مهم نظیر سودوموناس ایروژینوزا، استافیلوکوکوس اورئوس، استرپتوکوکوس پنومونیه توسط پمپ های دفع آنتی بیوتیکی مختلف ایجاد شده است. در بیشتر موارد این پمپ های دفع آنتی بیوتیکی فقط موجب افزایش MIC آنتی بیوتیک در میکروارگانیسم ها می گردند ولی همراه با مکانیسم های دیگر مقاومت آنتی بیوتیکی سبب ایجاد مقاومت سطح بالای معنی داری در باکتری ها می گردند. آنتی بیوتیک هایی مانند آمینوگلیکوزیدها، ماکرولید ها و فلوروکینولون ها بیشتر تحت تاثیر پمپ های ایفلاکس قرار می گیردند. پمپ های ایفلاکس از طریق بیوشیمیایی، میکروبیولوژی یا مولکولی شناسایی می شوند ولی بهترین راه شناسایی آنها از طریق توالی ژنومی آنها است. در روش میکروبیولوژی از عواملی استفاده می شود که عملکرد پمپ را مهار می کنند. از جمله این مواد می توان به کربونیل سیانید m-کلروفنیل هیدرازون CCCP)) اشاره نمود. این ترکیب به دلیل داشتن سیانور در ساختمان خود می تواند با مهار سیتوکروم اکسیداز زنجیره انتقال الکترون را مهار کرده و فسفریلاسیون را از اکسیداسیون جدا کند. با این عمل گرادیان الکتروشیمیایی یون های پروتون در غشاء تخریب می شود. بنابراین ترکیب مذکور می تواند همه ی پمپ های تراوشی را که از نیرو محرکه پروتونی برای خروج مواد ضد میکروبی از سلول استفاده می کنند مهار کرده و سطح مقاومت دارویی در باکتری کاهش می یابد.
بررسی پمپ های ایفلاکس:
الف- کشت: در این روش باکتری در دو پلیت مجزای دارای محیط مولر هینتون آگار مانند روشی که در بالا توضیح داده شده است کشت می گردد.
ب- دیسک گذاری: در این روش دیسک های آنتی بیوتیک هایی مانند آمینوگلیکوزیدها، ماکرولیدها و یا فلوروکینولون ها در دو پلیت دارای محیط کشت مولر هینتون آگار گذاشته می شود. یکی از این پلیت ها بدون مهار کننده CCCP و دیگری دارای مهار کننده CCCP می باشد.
ج- انکوباسیون: ۱۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد
د- نتایج و تفسیر: پس از انکوباسیون قطر هاله بدون رشد آنتی بیوتیک در پلیت دارای CCCP و بدون CCCP اندازه گیری شده و در صورتیکه قطر هاله بدون رشد در حضور مهار کننده بیشتر شده باشد نشان از اثر پمپ ایفلاکس در مقاومت آنتی بیوتیک دارد.

پاسخ دهید