معماری

روش انتشار از دیسک

این روش برای نخستین بار توسط دانشمندانی به نام های Kirby، Bauer و Sherris در سال ۱۹۶۶ ارائه شد و به همین جهت نام دیگر روش انتشار دیسک، روش Kirby-Bauer است. در این روش از دیسک های کاغذی آغشته به آنتی بیوتیک استفاده می شود، به همین جهت آنها را دیسک های آنتی بیوتیک می نامیم.
مراحل انجام آزمایش انتشار از دیسک:
الف- تهیه سوسپانسیون باکتری:
پس از تعیین هویت کامل یا اولیه باکتری باید سوسپانسیونی از آن را آماده نمود. بدین منظور با استفاده از یک لوپ یا سواب حداقل چهار کلنی مشابه از نمونه تعیین هویت شده را به یک لوله آزمایش دارای محیط کشت استریل منتقل کرد. باکتری های متصل شده را باید کاملا در محیط کشت به حالت سوسپانسیون در آورد (شکل ۱).

ب- تعیین تقریبی تعداد باکتری موجود در سوسپانسیون:
به دلیل اینکه به کار بردن تعداد کم و یا زیاد باکتری منجر به یافته های اشتباه خواهد شد، استفاده از تعداد مناسب باکتری مورد آزمایش بسیار مهم است. بنابراین باید پس از آماده سازی سوسپانسیون دارای باکتری از روش کدورت سنجی استفاده کرده و تعداد تقریبی باکتری را در آن محلول مشخص نمود. این مرحله را در اصطلاح استاندارد نمودن تعداد باکتری می گویند. برای این منظور در آزمایشگاه ها از محلول استانـدارد نیم مک فارلند (Mc.Farland 0.5) استفاده می شود (کادر ۱). بدین ترتیب محیط کشت مایع دارای باکتری را با مایع نیم مک فارلند مقایسه نموده و اگر از نظر کدورت مشابه هم باشند تعداد CFU/ml 108×۵/۱ (کادر ۲) از باکتری در محیط کشت خواهد بود. برای مقایسه کدورت این دو می توان از چشم غیر مسلح و یا از دستگاه های کدورت سنجی و یا اسپکتروفتومتر استفاده نمود.

ج- کشت دادن باکتری روی محیط مناسب:
برای انجام تست حساسیت میکروبی از محیط کشت مولر هینتون آگار استفاده می شود. این محیط از نظر شرایط محیط مانند pH، غلظت کاتیون ها و مقدار تایمیدین توسط کارخانه سازنده استاندارد شده است. در مورد باکتری های سخت گیر (Fastidious) می توان مواد افزودنی مانند خون به این محیط اضافه نمود. این محیط ها در اختیار شما قرار خواهد گرفت. در این مرحله با استفاده از سواب باکتری مورد آزمایش را در محیط کشتی که به صورت پلیت در اختیار شما قرار گرفته است به روش spreading کشت دهید به طوری که در همه جای پلیت باکتری به صورت یکنواخت کشت شده باشد (شکل ۲- مراحل شکل ازچپ به راست است).

د- دیسک گذاری:
حداکثر تا پانزده دقیقه پس از تلقیح پلیت باید دیسک های آنتی بیوتیکی را بر روی سطح آن قرار داد. آنتی بیوتیک ها به صورت دیسک در اختیار شما قرار خواهند گرفت. غلظت مناسب دارو برای هر دیسک قبلاً توسط موسساتی مانند FDA و CLSI تعیین شده و روی هر دیسک نوشته شده است. نام آنتی بیوتیک ها نیز به صورت اختصاری روی دیسک نوشته شده است (شکل ۳). پس از کشت دادن باکتری دیسک های انتخاب شده در شرایط استریل و با استفاده از پنس به صورت کاملاً تخت بر روی سطح آگار قرار داده می شود (شکل ۴). دیسک باید فقط یک بار با سطح آگار تماس یابد و از گذاشتن و برداشتن آنها خودداری کنید. پس از گذاردن همه دیسک ها آنها را با کمی فشار ثابت کنید که با وارونه کردن پلیت از سطح آگار جدا نشوند. فاصله دیسک ها از همدیگر نباید کمتر از ۱۵ میلی متر (مرکز به مرکز) باشد. دیسک ها از دیواره پلیت نیز باید ۱۲ میلی متر فاصله داشته باشند.

ه- انکوباسیون:
پس از دیسک گذاری پلیت را نام گذاری نموده و آنرا در داخل انکوباتور قرار دهید. در مورد بسیاری از ارگانیسم ها انکوباسیون در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد و زمان ۱۸ ساعت انجام می گردد. مواردی نیز به عنوان استثناء وجود دارد که باید بر اساس قواعد استاندارد CLSI یا سایر موسسات انکوبه گردند. روش انتشار دیسک برای ارگانیسم هائی که به زمان زیادی برای رشد نیاز دارند مناسب نمی باشد.
و- تفسیر نتایج:
پیِش از خواندن نتیجه باید پلیت را از نظر رشد مناسب، هم گون و خالص بودن گونه باکتری بررسی کرد (کلنی ها باید یک شکل باشند). اگر هاله نبود رشد نامشخص و درهم باشد تکرار آزمایش لازم است. در صورت خالص بودن کشت و نیز مشخص بودن هاله نبود رشد باید مراحل اندازه گیری آن انجام گیرد (شکل ۵). در مرحله اندازه گیری بدون باز کردن در پلیت و تنها از پشت پلیت و استفاده از خط کش (یا کولیس) قطر هاله نبود رشد اندازه گیری و بر اساس میلی متر ثبت می شود.
به منظور تفسیر این نتایج از جداول استانداردی که مؤسسات مختلف تهیه نموده اند استفاده می گردد (جدول ۲). با استفاده از این جداول و اندازه قطر هاله نبود رشد هر داروی ضد میکروبی، باکتری در یکی از دسته های مقاوم (Resistant)، نیمه حساس (Intermediate) و حساس (Sensitive) قرار می گیرد. این تفسیر ها بر اساس اعدادی انجام می گیرد که در آزمایشات متعدد و در نظر گرفتن بسیاری از متغیر ها به دست آمده اند. این اعداد را Breakpoint می نامند.

Resistant    Intermediate    Susceptible
Tetracycline    <14    ۱۵-۱۸    >19
Chloramphenicol    <12    ۱۳-۱۷    >18
Cotrimoxazole    <10    ۱۱-۱۵    ≥۱۶
Nitrofurantoin    <14    ۱۵-۱۶    >17
Erythromycin    <13    ۱۴-۲۲    >23
Gentamycin    <12    ۱۳-۱۴    >15

پاسخ دهید