معماری

روش های تهیه گسترش و رنگ آمیزی

درون پروتوپلاست باکتری ها موادی وجود دارد که ضریب شکست نوری و دانسیته آن ها نسبت به محیط اطراف متفاوت است. این تفاوت آن اندازه نیست که تنها با استفاده از میکروسکوپ های نوری معمولی و بدون رنگ آمیزی، باکتری قابل مشاهـده باشد، لذا چندین روش گوناگون رنگ آمیـزی ابداع شده تا بتـوان بر پایه هر روش تمام سلول باکتـری و یا قسمت هایی از آن را مطالعه نمود. می توان از رنگ آمیزی به عنوان نخستین قدم در تشخیص باکتری ها استفاده کرد.
مطالعه باکتری:
باکتری های رنگ آمیزی نشده به سختی در زیر میکروسکوپ دیده می شوند. در بیشتر موارد در آزمایشگاه های میکروب شناسی مشاهده دقیق باکتری ها، بررسی های مورفولوژیک و یا تعیین اندازه باکتری اهمیت زیادی دارد و در این موارد لازم است که از میکروارگانیسم گسترش تهیه کرده و با روش های انتخابی رنگ آمیزی نمود. تمامی باکتری ها در جریان رنگ آمیزی کشته می شوند. برای رنگ آمیزی باید از باکتری گسترش (Smear) تهیه و سپس بر حسب روش رنگ آمیزی، باکتری را رنگ نمود.

تهیه گسترشsmear) ):
۱- انتقال باکتری بر روی لام:
نخست لام را با الکل و دستمال تمیز کرده(در صورت لزوم) و یک قطره محیط مایع یا جامد (با روش عنوان شده در زیر) را بر روی لام قرار داده و به صورت لایه ای نازک پخش شود. اگر این لایه ضخیم باشد نور به خوبی از آن عبور نکرده و میدان دید میکروسکوپی تاریک به نظر می رسد. برداشت از محیط مایع و جامد به منظور تهیه گسترش به صورت زیر است.
الف- برداشت از محیط مایع:
اگر هدف تهیه گستره از باکتری رشد کرده در محیط مایع باشد نخست لوپ را روی شعله استریل کرده و برای مدتی خارج از شعله نگه داشته تا خنک شود. به کمک لوپ از داخل محیط کشت مایع مقداری باکتری خارج و بر روی لام قرار داده و با حرکت دورانی از مرکز به شکل بیضی و با رعایت فاصله مناسب از لبه های لام پخش نمایید. لوپ را فورأ بعد از انتقال باکتری بر روی لام، با شعله استریل کنید.

ب- برداشت از محیط جامد:
یک قطره سرم فیزیولوژی روی لام ریخته و با استفاده از لوپی که روی شعله استریل شده یک کلنی باکتری را برداشته و در قطره روی لام سوسپانسیون یکنواختی تهیه و پخش شود. هر چه گستره نازک تر و یکنواخت تر باشد بررسی میکروسکوپی آن راحت تر صورت می گیرد.

۲- خشک کردن (Drying):
بعد از قرار دادن باکتری بر روی لام، سوسپانسیون مدت ۲-۱ دقیقه در مجاورت هوا خشک می شود. بهتر است لام را به صورت مایل قرار داده و از دست زدن به آن پرهیز کرد. برای خشک کردن لام نباید از شعله استفاده نمود. گسترش مورد نظر باید کاملأ خشک گردد.

۳- ثابت کردن Fixation)):
پس از خشک شدن برای جلوگیری از کنده شدن نمونه در حین رنگ آمیزی الزامی است نمونه بر روی لام ثابت شود. این کار فیکس کردن نمونه نام دارد. روش های فیکس کردن متنوع بوده ولی معمولا از حرارت یا الکل استفاده می شود. در روش حرارت، پشت لام سه مرتبه از روی شعله عبور داده می شود. وظیفه شعله چسبانیدن گسترش بر روی لام است. لازم است پس از این که لام سه مرتبه از روی شعله عبور داده شد با پشت دست حرارت لام امتحان شود به گونه ای که گرما احساس شود اما این حرارت نباید خیلی کم و یا سوزاننده باشد زیرا در صورت کم حرارت دادن نمونه فیکس نشده و در صورت زیاد حرارت دادن مورفولوژی باکتری تغییر می کند.

۴- رنگ آمیزی Staining)):
برای این که یک ماده رنگی بتواند باکتری ها و بافت ها را رنگ آمیزی کند باید افزون بر ریشه رنگی که آن را کروموژن می نامند ریشه دیگری نیز داشته باشد که پس ازحل شدن در آب یونیزه شده و ماده رنگی را دارای بار الکتریکی مثبت یا منفی نماید تا بتواند با مواد اسیدی یا بازی سلول ها ترکیب شود که این ریشه را اگزوکروم می نامند.
رنگ هایی که پس از یونیزه شدن دارای بار الکتریکی منفی باشند، به نام رنگ های اسیدی معروفند و با مواد بازی  سلول ها که بار الکتریکی مثبت دارند ترکیب می شوند مانند ائوزین.
رنگ هایی که پس از یونیزه شدن دارای بار الکتریکی مثبت باشند به نام رنگ های بازی معروفند ومی توانند با مواد اسیدی سلول ها که بار منفی دارند ترکیب شوند مانند بلودومتیلن.
چون درسیتوپلاسم مقدار زیادی اسید نوکلئیک وجود دارد که دارای بار الکتریکی منفی است، باکتری ها میل ترکیبی زیادی به رنگ های بازی دارند. از رنگ های اسیدی برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده نمی شود ولی برای رنگ کردن زمینه گسترش مناسب اند.
از بعضی مواد رنگی می توان برای از بین بردن، جلوگیری از رشد و تهیه محیط های کشت ویژه باکتری ها استفاده نمود.
روش های رنگ آمیزی براساس تعداد رنگ و مراحل رنگ آمیزی به دو دسته رنگ آمیزی ساده و مرکب (Complex) تقسیم می شوند:
الف- رنگ آمیزی ساده:
دراین روش تنها از یک ماده رنگی استفاده و همه باکتری ها به یک رنگ دیده می شوند. می توان به وجود، تعداد تقریبی سلول باکتری در نمونه و به شکل باکتری پی برد.
ب- رنگ آمیزی مرکب:
در این روش از دو یا چند ماده رنگی استفاده می شود. یکی به عنوان رنگ اصلی و دیگری به عنوان رنگ مخالف (Counter stain) به کار می رود. روش های بسیار گوناگونی برای رنگ آمیزی باکتری ها به روش مرکب وجود دارد که مهم ترین و کاربردی ترین آن ها رنگ آمیزی گرم (Gram) است.
مکانیسم رنگ آمیزی گرم:
این روش تفاوت شیمیایی بین دیواره در دو گروه میکروارگانیسم ها را مشخص می کند. گروهی از باکتری ها که گرم مثبت نامیده شده و پس از رنگ آمیزی بنفش رنگ می شوند و گروهی که گرم منفی هستند و در نتیجه رنگ آمیزی‏‏، قرمز رنگ می شوند.
بیشتر باکتری ها پس از رنگ آمیزی با رنگ های پارا روزانیلین مانند کریستال ویولت و تثبیت رنگ ها، هنگامی که در معرض ترکیبات رنگ بر مانند الکل یا استون قرار گیرند رنگ خود را از دست نمی دهند در حالی که گروهی از باکتری ها در این مرحله رنگبری می گردند. باکتری هایی که پس از مرحله رنگبری، رنگ خود را حفظ نموده، گرم مثبت و باکتری هایی که بی رنگ می شوند گرم منفی نام می گیرند. برای بهتر دیده شدن باکتری های بدون رنگ می توان از رنگ دوم استفاده کرد که با رنگ اول متفاوت باشد در این حالت باکتری های گرم منفی با رنگ دوم (سافرانین) قرمز رنگ می شوند.
مکانیسم رنگ آمیزی گرم تا کنون به طور کامل شناخته نشده و به نظر می رسد که تنها ترکیبات شیمیایی دیواره سلولی بیان کننده چگونگی رنگ آمیزی گرم باشد. به علت این که سلول های مخمر که دارای دیواره سلولی ضخیمی هستند (هرچند که از لحاظ ساختمان شیمیایی با باکتری های گرم مثبت متفاوتند) دراین رنگ آمیزی گرم مثبت می گردند بنابر این به نظر می رسد که پدیده های فیزیکی مانند ضخامت دیواره سلولی، منافذ و قابلیت نفوذ پذیری پوشش سالم سلول نیز در رنگ آمیزی گرم اهمیت داشته باشند. هم چنین چند فرضیه دیگر در این زمینه وجود دارد که توضیح داده می شود.
۱- ویوله و ید در داخل باکتری ها با هم ترکیب شده و مولکول درشتی را به وجود می آورند که از جدار باکتری های گرم مثبت نمی تواند خارج شود ولی از جدار باکتری های گرم منفی که قابلیت نفوذ بیشتری دارد به آسانی خارج می شوند.
۲- قسمت بیشتر دیواره باکتری های گرم مثبت از پپتیدوگلیکان و یا موکوپپتید تشکیل شده که از نفوذ الکل-استون به داخل باکتری جلوگیری کرده و مولکول کریستال ویوله نمی تواند درآن حل شده و از باکتری خارج شود. درصورتی که قسمت بیشتر دیواره سلولی باکتری های گرم منفی از لیپوپروتئین تشکیل شده که اگر تحت تاثیر الکل-استون (حلال چربی) قرار گیرد، قابلیت نفوذ بیشتری پیدا می کند و این مواد داخل باکتری شده، مولکول کریستال ویوله و ید را در خود حل کرده و از باکتری خارج می نمایند.
این روش کاربردی ترین روش رنگ آمیزی در باکتری شناسی است و در تشخیص مقدماتی باکتری ها اهمیت زیادی دارد.
ترکیبات رنگ آمیزی گرم:
کریستال ویوله: رنگ اولیه یا رنگ اصلی
محلول ید( لوگل):  رنگ دندانه (Mordant)
الکل استون: رنگ برDecolorizer))
سافرانین: رنگ دوم counter stain) )
روش کار:
۱- ریختن رنگ کریستال ویوله روی گسترش فیکس شده ← ۱ دقیقه
۲- شستشو با آب
۳- ریختن لوگل بر روی گستره ← ۱ دقیقه
۴- شستشو با آب
۵- رنگ بری با الکل-استن به مدت x ثانیه. این مرحله اهمیت فراوانی دارد چرا که کمتر یا بیشتر شدن زمان کاملأ در نتیجه رنگ آمیزی اختلال ایجاد می کند. می توان به جای انتخاب زمان رنگ بری، لام را کمی شیب دار گرفته و از قسمت بالای گسترش الکل-استن را قطره قطره روی گسترش ریخت تا حدی که از گسترش، دیگر رنگ بنفش خارج نشود.
۶- شستشو با آب
۷- ریختن سافرانین ← ۴۰-۳۰ ثانیه
۸- شستشو با آب
(لازم به ذکر است که از هر مرحله به مرحله بعد نیازی به خشک کردن لام نیست.)

مرحله پایانی، خشک کردن لام در مجاورت هوای آزمایشگاه و یا با روش Blotting (استفاده از کاغذ خشک کن)

پاسخ دهید