معماری
میکروب کار

نگهداري از سويه‌هاي باکتريايي

 نگهداري و استفاده از سويه‌هاي باکتريايي

براي نگهداري سويه‌هاي باکتريايي مي‌توان از  روشهاي طولاني مدت و کوتاه مدت استفاده نمود.

الف) نگهداري طولاني مدت

نگهداري طولاني‌مدت باکتريها اين امکان را مي‌دهد که کليه سويه‌هاي ميکروبي اعم از هوازي (با رشد سريع و يا سخت رشد) و نيز بيهوازي، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند. بهترين روشهاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتي‌گراد يا پايين تر (در ديپ فريز يا در نيتروژن مايع) مي‌باشد.

 

  • نگهداري در ديپ فريز ( 50- تا 70- درجه سانتي‌گراد يا پايين تر) و يا نيتروژن مايع:

 

باکتري مورد نظر را روي محيط مغذي مانند پليتTSA (Trypticase Soy Agar)   حاوي 5% خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط آگار شکلاته کشت دهيد. پليتها را به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه سانتي‌گراد و در صورت نياز تحت شرايط CO2 براي هر باکتري انکوبه نمائيد.

بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تستهاي بيوشيميايي آنرا انجام دهيد. سپس از باکتري رشد يافته، سوسپانسيون غليظي در 100-50 ميلي‌ليتر از يک محيط محافظت‌کننده از سرما (Cryoprotective) تهيه نمائيد. اين محيط براي جلوگيري از تخريب سلولهاي باکتري در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي‌گيرد. محيط محافظت‌کننده از سرما مي‌تواند Skim milk، خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه استريل يا Tryptic Soy Broth (TSB)  حاوي گليسرول با غلظت نهايي 15-10% باشد.

سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدارml  1- 5/0 در ويالهاي شيشه‌اي يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد. تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد.

ويالهاي حاوي سويه‌ها را مي‌توان در برودت  50- تا 70- درجه سانتي‌گراد به مدت يکسال نگهداري نمود. در صورت عدم دسترسي به فريزر 70- درجه مي توان سويه‌هاي با رشد سريع را در فريزر 20- درجه نيز نگهداري نمود. در اين شرايط توجه به نکات زير ضروري است:

سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوانزا و نيسريا گونوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در  فريزر 70- درجه نگهداري شوند.

سويه‌هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين مي‌روند. بنابراين توصيه مي‌شود براي اطمينان از حيات سويه‌ها هر چند ماه، طبق روش زير کشت داده شوند.

يک ويال از فريزر بيرون آورده و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه و در صورت نياز در شرايط CO2 انکوبه نماييد. اين باکتري مي‌تواند براي آزمايشهاي کنترل داخلي کيفيت در آزمايشگاه يا براي تهيه working control بکار رود. قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن نمونه، اطمينان حاصل کرد. ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده و به هيچ وجه مجددا فريز نگردد.

کشتهاي working control:  عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي کنترل کيفيت محيط کشت و … استفاده مي‌شود.

از کشت ذخيره تا 3 پاساژ پشت سر هم مي‌توان انجام داد. پس از آن، نمونه بايد دور انداخته شده و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر براي تهيه کشتهايworking control  استفاده شود. پاساژهاي مکرر (بيش از 3 پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه‌ها را افزايش مي‌دهد.

براي تهيه working control، از کشت ذخيره فريز شده، روي پليت يا آگار شيب دار تلقيح  و آنرا به مدت يک شبانه‌روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد، انکوبه نمائيد. در مورد ارگانيسمهاي با رشد سريع اين پليت يا آگار شيبدار را مي‌توان در 8-2 درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت 4 هفته نگهداري نمود. بعد از هر پاساژ، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نمائيد.

 

2- استفاده از روغن معدني در دماي اتاق:

1- محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) را با شيب کم در لوله تهيه نماييد. براي باکتريهاي مشکل‌پسند مانند گونوکوک، مننگوکوک، استرپتوکوک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا، لازم است محيط شکلات آگار را با افزودن 5% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای 50 درجه سانتی‌گراد و قرار دادن در بن‌ماري 80 درجه سانتي‌گراد به مدت 15 دقيقه تهيه نمود.

2- روغن معدني (يا پارافين مايع) را در حرارت خشک (170 درجه سانتي‌گراد به مدت يکساعت) استريل نمائيد.

3- ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت دهيد.

4- بعد از بدست آوردن کشت کافي، روغن استريل را به مقدار cc 1 روي سطح محيط بريزيد.

5- در صورت نياز به کشت مجدد، نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته مي‌شود.

6- بعد از 12-6 ماه تجديد کشت نماييد.

 

3- کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق:

اين روش فقط براي باکتريهايي که مشکل‌پسند نيستند مانند استافيلوکوک وخانواده انتروباکترياسه بکار مي‌رود.

  • يک محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات مانند TSA را با عمق زياد در لوله تهيه نماييد.
  • باکتري را بصورت کشت عمقي در اين محيط تلقيح نماييد.
  • اين محيط را 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه انکوبه نمائيد.
  • در لوله را با درپيچ يا چوب پنبه ببنديد.
  • لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.
  • کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.
  • هرساله سوش موردنظر را تجديد نمائيد.

 

4- کشت عمقي در محيط سيستين تريپتيکيس آگار (CTA) براي نيسريا و استرپتوکوک:

  • محيط CTA را در لوله تهيه نماييد .
  • باکتري را بطور عمقي در اين محيط کشت دهيد.
  • محيط را بمدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.
  • در لوله را با چوب‌پنبه يا در پيچ ببنديد.
  • لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.
  • براي نيسريا لوله را در 35 درجه نگهداري و هر دو هفته کشت را تجديد نمائيد. براي استرپتوکوک لوله را در حرارت اتاق نگهداري کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد.

 

 

 

5- محيط کشت Cooked meat  براي باکتريهاي بيهوازي:

  • باکتري را در لوله‌هاي حاوي محيط Cooked meat کشت دهيد.
  • محيط را بمدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.
  • در لوله را با چوب‌پنبه يا در پيچ ببنديد.
  • کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.
  • هر دو ماه کشت را تجديد نمائيد.

 

ب) نگهداري کوتاه مدت

کشتهاي working control که براي کارهاي روتين روزانه استفاده مي‌شوند، به روشهاي زير تهيه مي‌شوند:

  • باکتريهاي با رشد سريع
  • سوش مورد نظر را در سطح محيط TSA لوله‌اي درپيچ‌دار کشت دهيد.
  • محيط را بمدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.
  • پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيد
  • هر ماه کشت را تجديد نمائيد.

 

  • استرپتوکوکها
  • سوش مورد نظر را در سطح آگار خوندار شيب دار( لوله‌اي درپيچ‌دار) کشت دهيد.
  • محيط را بمدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.
  • پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيد. ( جهت استرپتوکوک پنومونيه، محيط را در دماي اتاق نگهداري کنيد.)
  • هر ماه کشت را تجديد نمائيد.

 

  • مننگو‌کوک و هموفيلوس
  • سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته لوله‌اي يا پليت کشت دهيد.
  • محيط را بمدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.
  • پس از رشد کامل، لوله را در حرارت اتاق نگهداري کنيد

4-  هر2 هفته کشت را تجديد نمائيد.

 

  • گونوکوک
  • سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته کشت دهيد.
  • محيط را بمدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.
  • نمونه را در دماي 35 درجه نگهداري نماييد.
  • هر2 روز يکبار کشت را تجديد نمائيد.

 

پاسخ دهید