معماری

آزمایش متیل رد

تشخیص و تمایز اعضای خانواده انتروباکتریاسه براساس میزان فرآورده نهائی ناشی از متابولیسم گلوکز و تولید اسید از طریق مسیر Mixed  Acid  Fermentation

 

  • اساس آزمایش:

معرف متیل رد یک اندیکاتور pH است که در محدوده بین pH= 6 (زرد ) و pH= 4.4 (قرمز ) واکنش نشان می دهد. اسیدیته ای که در آن معرف متیل رد قادر است تا تغییر رنگ ایجاد نماید بسیار کمتر از سایر معرفهای بیولوژیکی بوده و تنها در مجاورت اسیدیته بالا، در مسیر تخمیر چند اسید از گلوکز می تواند ایجاد واکنش نماید.

برخی از انتروباکتریاسه فقط در ابتدای دوره انکوباسیون تولید اسید می نمایند ولی تنها باکتریهایی که قادر باشند برای مدت طولانی طی انکوباسیون (۷۲-۴۸ ساعت) pH محیط را در حد پایین حفظ نمایند دارای واکنش مثبت می باشند.

 

۳- نمونه اولیه:

کشت  خالص و تازه از باکتری مورد نظر (کشت ۲۴ -۱۸ ساعته)

 

۴-  مواد و معرفها:

  • MR/VP Broth با pH نهایی  ۹/۶
  • معرف متیل رد که عبارت است از ۱ g پودر متیل رد در ۳۰۰ ml  الکل اتیلیک ۹۵%  و ۲۰۰ ml  آب مقطر

توجه: ابتدا پودر متیل رد را باید در الکل حل نمود و سپس آب به آن اضافه کرد. محلول تهیه شده را باید در شیشه تیره و در یخچال نگهداری نمود. جهت مصرف روزانه و هفتگی آنرا در لوله های در پیچ دار به حجم ۵/۲میلی لیتر ریخته و در یخچال بگذارید.

 

 ۵-  روش انجام آزمایش:

  • ابتدا چند کلنی از کشت خالص باکتری را در لوله حاوی ۵/۲ میلی لیتر MR/VP Broth تلقیح نمایید.

– ۷۲-۴۸ ساعت ( حداکثر ۵ روز)  در°C 35   انکوبه نمائید.

– سپس  ۵ قطره از معرف متیل رد را به Broth اضافه نمایید و نتیجه واکنش را بر اساس تغییر رنگ حاصله بررسی کنید.

ایجاد رنگ زرد               واکنش منفی

ایجاد رنگ قرمز               واکنش مثبت در نتیجه تولید اسید زیاد و ایجاد pH<4.5  است.

ایجاد رنگ نارنجی            واکنش منفی

 

جهت کوتاه تر کردن زمان نتیجه گیری می توان حدود ۵/۰ میلی لیتر MR/VP Broth   را در لوله ای ریخته و مقدار نسبتاً زیادی از میکروب را در آن تلقیح نمود و پس از انکوباسیون ۲۴-۱۸ ساعته در ۳۵°C ،  ۲-۱  قطره معرف متیل رد  را به آن اضافه کرده، واکنش را مشاهده نمود.

 

۶-  برنامه  کنترل کیفی:

کنترل مثبت:  ۲۵۹۲۲     E. coli  ATCC

کنترل منفی:  انتروباکتر آئروژینوزا ۱۳۰۴۸،  Klebsiella Pneumoniae  ATCC  ۱۳۸۸۳

 

توجه :  در هر روز کاری، قبل از انجام آزمایش، کنترل کیفی باید با سویه های مثبت و منفی انجام شود.

پاسخ دهید