معماری

کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی

کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی:

اصطلاحات مربوط به سویه های میکروبی کنترل

  • سویه کنترل (Control Strain): میکروارگانیسمی که برای ارزیابی عملکرد میکروبی محیط کشت استفاده می شود.
  • سویه مرجع (Reference Strain): میکروارگانیسمی که حداقل تا سطح جنس و گونه شناسایی شده و بر اساس ویژگی ها و ترجیحاً منشا آن، فهرست بندی و تعریف شده است.
  • ذخیره های مرجع (Reference Stocks): کشت های بدست آمده از پاساژ سویه مرجعی که از مراکز بین المللی تهیه شده است.
  • ذخیره های کاری (Working Stocks): کشت مجددی که از کشت های ذخیره جهت کنترل کیفیت محیط های کشت استفاده می شود.

 

منبع سویه های کنترل:

همه سویه های کنترل که در جدول ۲ از آنها نام برده شده است، ATCC  می باشند

.(American type culture collection) این سوشها، حداقل سوشهایی هستند که باید برای ارزیابی هر محیط کشت استفاده شوند. ارگانیسم های مورد استفاده برای اهداف کنترل کیفی می تواند از سویه های National collection باشد. سویه های دیگری نیز ممکن است توسط سازنده محیط کشت به کار رود که شامل مجموعه ای از سویه های وحشی (Wild strain) یا بدست آمده از نمونه های بیمار می باشد که مختص هر آزمایشگاه بوده و برای انجام آزمایش های بیشتر به کار می روند.

 

روش انجام آزمون کنترل کیفیت محیط های کشت

تهیه سوسپانسیون میکروبی:

یک کشت از ارگانیسم کنترل کیفی روی پلیت بلادآگار تهیه کنید. بعد از انکوباسیون پلیت ۵-۳ کلنی ایزوله را در مقدار کمی تریپتیکیس سوی براث (TSB) استریل حل نمایید تا سوسپانسیون میکروبی حاصل شود و آن را برای چهار یا پنج ساعت انکوبه نمایید. سپس کدورت آن را با استاندارد نیم مک فارلند تنظیم کنید. (استاندارد نیم مک فارلند در طول موج ۶۲۵ nm، دارای جذب ۰۸/۰ تا ۱/۰ ناتومتر می باشد)

به جای این روش می توان مستقیماً از کلنی های ایزوله روی پلیت، سوسپانسیون میکروبی مطابق با کدورت نیم مک فارلند تهیه کرد. بدین ترتیب که ۵-۳ کلنی ایزوله روی پلیت ۲۴ ساعته را در ۵-۳ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل کرده و کدورت آن را با نیم مک فارلند تنظیم نمایید. با هر روشی که این سوسپانسیون میکروبی تهیه شود، باید کدورتی حاوی ۱۰۷-۱۰۸ CFU/ml کلنی داشته باشد. (مطابق با استاندارد نیم مک فارلند).

 

بررسی آزمایش های عملکردی محیط کشت (Performance testing)

۱- آزمایش ظرفیت مغذی بودن (Nutritional activity) محیط  های کشت پلیتی مانند بلاد آگار

سوسپانسیون اولیه را به نسبت ۱ به ۱۰۰ در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ ۱۰ یا ml 01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 104-103 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون را ده بار رقیق تر تهیه نمایید.

 

۲- آزمایش ظرفیت مهار کنندگی محیط های کشت انتخابی پلیتی مانند مکانکی آگار

سوسپانسیون اولیه را به نسبت ۱ به ۱۰ در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ ۱۰ یا       ml01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح  کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 105-104 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون ده بار رقیق تر تهیه شود.

 

۳- آزمایش محیط های کشت لوله ای

هر لوله باید با lµ ۱۰ یا  ml01/0 از سوسپانسیون اولیه تهیه شده مطابق با نیم مک فارلند (بدون رقیق سازی) تلقیح شود. گاهی ممکن است به تلقیح کمتر یا بیشتر نیاز باشد.

 

محیط مورد آزمون را بعد از تلقیح تحت شرایطی که در جدول ۲ آمده است، انکوبه نمایید. به طور نرمال  زمان انکوباسیون، ۲۴-۱۸ ساعت یا ۴۸-۲۴ ساعت در دمای Cº ۲±۳۵ می باشد. محیط شکلات آگار و سایر محیط های کشت برای جداسازی انتخابی گونه های نیسریای بیماریزا باید در ۱۰- ۵% Co2 انکوبه شوند و در فواصل زمانی۲۴-۱۸ ساعت وسپس ۴۸-۲۴ ساعت بررسی گردند.

برای باکتری های بی هوازی، کشتها عموماً به حداقل ۴۸ ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی و غنی از Co2 نیاز دارند.

در مورد کمپیلوباکتر آگار، پلیتها باید در Cº ۴۲ در شرایط میکروآئروفیلیک غنی از Co2 به مدت ۴۸ ساعت انکوبه شوند.

 

۴- کنترل محیط های کشت برای آزمایشهای بیوشیمیایی

از سوسپانسیون میکروبی رقیق نشده برای کنترل این محیطها استفاده می کنیم.

پس از تلقیح، تمام کشت ها را در شرایط لازم (از نظر Co2، رطوبت و یا شرایط بیهوازی و درجه حرارت مناسب) قرار داده و پس از طی مدت زمان لازم (۲۴ تا ۴۸ ساعت) آنها را مورد بررسی قرار می دهیم. محیط های مناسب دارای رشد کافی از کلنی های باکتریهای مورد نظر می باشند و در مورد محیطهای انتخابی مهار میکروارگانیسمهای مورد نظر باید مشخص باشد.

 

کنترل محیط های ساخته شده تجاری (آماده مصرف):

  • رطوبت: محیطهای کشت باید بدون هر گونه رطوبت اضافی بوده، همچنین هیچ نشانه ای از خشک شدن اطراف محیط کشت نباید مشاهده گردد.
  • سترون بودن: محیطهای کشت باید عاری ازآلودگی باشند.

رنگ: محیطهای کشت آگار خوندار نباید هیچ نشانه ای از همولیز داشته باشند و محیطهای کشت دیگر نباید هیچگونه تغییر رنگ غیر طبیعی داشته باشند.

 

بررسی آلودگی محیط های کشت (استریل بودن محیط های کشت):

در صورتیکه تعداد پلیت یا لوله تهیه شده در هر سری ساخت یا Lot، ۱۰۰ عدد یا کمتر باشد، باید به تعداد ۵-۳% محیط های تهیه شده را در دمای Cº ۳۷-۳۵ به مدت ۵-۲ روز انکوبه نمود. برای Lot های با تعداد بیش از ۱۰۰، باید به تعداد ۱۰ پلیت یا لوله را به طور تصادفی برداشته و در شرایط فوق انکوبه نمود. بعد از انکوباسیون هیچ گونه رشد میکروبی نباید مشاهده شود.

 

تفسیر نتایج:

یک محیط کشت زمانی قابل قبول می باشد که با همه سویه های پیشنهادی برای آزمون محیط کشت که در جدول ۲ مشخص شده است، رشد کافی داشته و خصوصیات مورفولوژیکی کلنی ها بارز باشد. در مورد محیط های انتخابی، رشد بعضی از ارگانیسم های خاص مهار می شود، ضمن اینکه اجازه رشد کافی به سایرارگانیسم می دهد. در بعضی موارد، واکنشهای رنگی خاص یا همولیز همچنانکه در جدول ۲ آمده است، باید ایجاد شود. مثلاً در مورد کشت بلادآگار ایجاد همولیز مناسب ضروری است و یا برای محیط مکانکی آگار ایجاد واکنش های رنگی برای سویه های میکروبی مشخص ضروری می باشد.

 

سایر معیارهای تضمین کیفیت:

محیطهای کشت آماده مصرف باید از نظرموارد زیر نیز بررسی شوند:

  • شکستگی ظروف پتری
  • پر شدن ناصاف پلیتها
  • ترک خوردگی محیط کشت در پلیتها
  • وجود همولیز (برای بلاد آگار)
  • یخ زدگی
  • وجود مقدار زیاد حباب یا حفره در سطح محیط کشت

جدول ۲

محیط کشت

زمان انکوباسیون ارگانیسم های کنترلی نتیجه قابل انتظار
بایل اسکولین آگار ۲۴ ساعت استرپتوکوک فکالیس S. faecalis

 

استرپتوکوک پایوژنزS. pyogenes

رشد مثبت، محیط سیاهرنگ می شود

 

رشد منفی

بلاد آگار

جار شمع دار CO2

۲۴ ساعت استرپتوکوک پایوژنز

Streptococcus pyogenes

 

استرپتوکوک پنومونیهS. pnemoniae

رشد مثبت دارای همولیزبتا

 

 

رشد مثبت دارای همولیز آلفا

شکلات آگار ۲۴ ساعت هموفیلوس آنفلوانزا

Haemophilus influenzae

رشد مثبت
لایزین دکربوکسیلاز

(محیط بوسیله روغن استریل پوشانده میشود)

۴۸ ساعت سالمونلا تایفی موریوم S. typhimurium

 

شیگلافلکسنری Shigella flexneri

مثبت (بنفش رنگ می شود)

 

منفی (بدون تغییر رنگ)

اورنیتین

(دکربوکسیلاز)

۴۸ ساعت سالمونلا تایفی موریومS. typhimurium

 

کلبسیلا پنومونیه K. pneumoniae

مثبت

 

منفی

آرژینین
(دی هیدرولاز)
۴۸ ساعت سالمونلا تایفی موریوم S. typhimurium

 

پروتئوس میرابیلیسProteus mirabilis

مثبت

 

منفی

ژلاتیناز ۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

باسیلوس سوبتیلیسBacillus subtilis

منفی

 

مثبت

کلایگلرآیرون آگار

 

۲۴ ساعت سیتروباکتر فروندیCitrobacter frundii

 

سالمونلا تایفی موریومS. typhimurium

 

شیگلا فلکسنری Sh. flexneri

 

اسینتوباکتر کالکوستیکوس

Acinetobacter calcoaceticus

گاز + A/A, SH2

 

گاز یا بدون گاز + K/A, SH2

 

K/A

 

تغییر نمی کند

مک کانکی آگار

(همراه با کریستال ویوله)

۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

پروتئوس میرابیلیسProteus mirabilis

 

استرپتوکوک فکالیس S. faecalis

کلنی های قرمز رنگ

 

کلنی های بیرنگ، بدون سوارمینگ (خزش)

 

رشد منفی

 

مالونات

 

۲۴ ساعت

اشرشیا کلی E. coli

 

کلبسیلا پنومونیهK. pneumonia

منفی (سبز رنگ)

 

مثبت (آبی رنگ)

مانیتول سالت آگار ۲۴ ساعت استافیلوکوک اورئوس S. aureus

 

 S. epidermidisاستافیلوکوک اپیدرمیدیس

 

اشرشیا کلی E. coli

کلنی های زرد رنگ

 

کلنی های قرمز رنگ

 

رشد منفی

MRVP ۴۸ ساعت اشرشیا کلیE. coli

 

کلبسیلا پنومونیهK. pneumonia

MR مثبت- VP منفی

 

MR منفی- VP مثبت

مولرهینتون آگار ۲۴ ساعت استافیلوکوک اورئوس

S. aureus ATCC 25923

 

سودوموناس آئروژینوزا

P. aeruginosa ATCC 27853

اشرشیا کلی E. coli ATCC 25922

به جدول میزان هاله عدم رشد قابل قبول در بخش آنتی بیوگرام مراجعه شود
نیترات براث ۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

اسینتوبا کتر کالکوستیکوس

Acinetobacter calcoaceticus

مثبت

 

منفی

آب پپتونه (اندول) ۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

کلبسیلا پنومونیه K. pneumoniae

مثبت

 

منفی

فنیل آلانین دآمیناز ۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

پروتئوس میرابیلیس  mirabilis. P

منفی

 

مثبت

سالمونلا شیگلا آگار (S.S)

یا دزوکسی کلات سیترات آگار

۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

سالمونلا تایفی موریوم

Salmonella typhimurium

 

یرسینیا انتروکولیتیکا

Yersinia enterocolitica

 

شیگلا فلکسنری Shigella flexneri

منفی

 

کلنی های بیرنگ

 

 

کلنی های بیرنگ

 

 

کلنی های بیرنگ

سلنیت برات

(SF)

۲۴ ساعت سالمونلا تایفی موریوم S. typhimurium

 

اشرشیا کلی E. coli

بعد از کشت مجدد رشد می کند

 

بعد از کشت مجدد رشد نمی کند

سیمون سیترات

(در لوله های با درپیچ شل در انکوباتور گذاشته شود)

۴۸ ساعت اشرشیا کلی  E. coli

 

کلبسیلا پنومونیهK. pneumonia

رشد منفی

 

رشد مثبت- رنگ آبی

TCBS آگار ۲۴ ساعت Vibrio SPP

 

کلنی های زرد رنگ
 

تایر مارتین

 

۲۴ ساعت

نایسریا مننژیتیدیس

 Neisseria meningitidis (CO2)

 

نایسریا گونورهN. Gonorrhoeae  

 

اشرشیا کلیE. coli

 

رشد مثبت

 

رشد مثبت

 

رشد منفی

تایوگلیکولات براث

Thioglycollate broth

۲۴ ساعت باکتروئیدس فراجیلیس

Bacteriodes fragilis

رشد مثبت
TSI

عمق محیط باید ۳ سانتی متر باشد

(با درپیچ شل اتوو گذاری شود)

۲۴ ساعت سیتروباکتر فروندی

Citrobacter frundii

 

سالمونلا تایفی موریومS. typhimurium

 

شیگلا فلکسنری Sh. flexneri

 

اسینتوباکتر کالکوستیکوس

Acinetobacter calcoaceticus

گاز + A/A, SH2

 

 

گاز یا بدون گاز + K/A, SH2

 

K/A

 

تغییر نمی کند

محیط اوره ۲۴ ساعت اشرشیا کلی E. coli

 

پروتئوس میرابیلیس P. mirabilis

منفی

 

مثبت، صورتی

 

پاسخ دهید