معماری
باسیل های گرم منفی سالمونلا

سالمونلا

تشخیص آزمایشگاهی سالمونلا،روش های شناسایی و آزمایش های رایت و ویدال،مشخصات باکتری سالمونلا،بیماریهای و علائم سالمونلا،محیط های تشخیصی برای سالمونلا،کشت مدفوع برای سالمونلا

جنس سالمونلا یکی از اعضای خانواده انتروباکتریاسه است که از طریق دهان وارد روده انسان ، حیوانات ، پستانداران و پرندگان می شود و سبب مسمومیت های غذایی ، سپتی سمی و تب روده ای ( تیفوئید یا حصبه ) میگردد.
سالمونلا به صورت باسیل گرم منفی ، فاقد کپسول ، متحرک و دارای فلاژل پری تریش است. در این جنس فقط سالمونلا گالیناروم و پولوروم بدون حرکت می باشند.
سالمونلا هوازی بی هوازی اختیاری است. از نمونه های خون ، آسپیراسیون مغز استخوان و مدفوع برای انجام کشت و تشخیص بیماری استفاده میگردد.
سالمونلا به سروگروه های زیر تقسیم بندی شده است
سالمونلا تیفی
سالمونلا پاراتیفی A
سالمونلا پاراتیفی B
سالمونلا پاراتیفی C
سالمونلا کلراسوئیس
سالمونلا انتریتیدیس
عفونت با سالمونلا به سه صورت تب روده ای ( تیفوئید یا حصبه ) ، مسمومیت های غذایی (گاستروآنتریت) و سپتی سمی دیده میشود.

XLD  و SS بریلینت گرین بیسموت سولفیت آگار تولید H2S و ایجاد کلنی های سر سیاه سالمونلا در محیط هکتون آگار مک کانکی

بررسی میکروسکوپی مستقیم
در عفونت گاستروآنتریت سالمونلایی در صورتی که اسمیر مستقیم مدفوع بررسی شود گلبول های سفید در مدفوع اسهالی دیده میشود.
کشت :
جهت کشت میتوان از نمونه مدفوع ، خون ، ادرار و… استفاده کرد. باید توجه داشت که برای تشخیص تب تیفوئیدی قبل از تجویز آنتی بیوتیک از نمونه بیمار کشت انجام شود
انواع مختلف محیط های کشت سالمونلا :
محیط های مغذی
محیط های انتخابی
محیط های انتخابی و افتراقی
محیط های غنی کننده

محیط های مغذی:
مانند آگار خوندار ، کلنی های سالمونلا اغلب بزرگ به قطر ۲ تا ۳ میلی متر به رنگ خاکستری با سطح محدب و مرطوب پس از ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد دیده میشوند.

سالمونلا تیفی در کلیگر آیرون آگار
محیط های انتخابی :
مانند محیط های کشت بریلیانت گرین ، بیسموت سولفیت ، HEA, XLD, SS
این محیط ها مانع رشد کلی فرمها میگردد و سالمونلاها در این محیط ها رشد می کنند.
محیط های انتخابی و افتراقی :
مانند محیط مک کانکی ، محیط EMB و DCA (دزوکسی کولات سیترات) ،کلنی هایی که روی این محیط ها نمایان می شوند  به علت عدم تخمیر قند لاکتوز بی رنگ هستند.
محیط های غنی کننده :
مانند محیط مایع سلنیت F ، محیط مایع GN ، این محیط ها از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری کرده و سرعت تکثیر سالمونلا و شیگلا در این محیط ها افزایش می یابد.

کشت مدفوع برای سالمونلا

روش کار :
نمونه مشکوک را بر روی محیط مک کانکی یا EMB و SS و همچنین بر روی محیط های غنی کننده مثل سلنیت F یا GN ، بریلیانت گرین ، بیسموت سولفیت آگار کشت داده و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت نگهداری کنید.
در روز بعد از محیط های سلنیت F یا GN بر روی محیط های کشت مناسب کشت داده میشود. از کلنی های مشکوک ( بی رنگ ) و SH2 دار میتوان جهت تست های بیوشیمیایی استفاده کرد.
در تب تیفوئیدی در حدود ۲۵% از موارد کشت مدفوع در هفته اول بیماری مثبت است. این میزان تا هفته سوم به حدود ۷۵ % افزایش می یابد.رشد سالمونلا در محیط غنی کننده سلنیت F

تایید تشخیص
برای تایید تشخیص باید از کلنی های سالمونلا بر روی محیط کلیگر آیرون آگار کشت داد که پس از ۲۴ ساعت به صورت آلکالن _اسید (تخمیر لاکتوز منفی و تخمیر گلوکز مثبت ) ظاهر میشوند.
همچنین برای تشخیص میتوان از تست های دیگری استفاده نمود که
تمام سالمونلاها بجز سالمونلا پاراتیفی A در محیط کلیگر ایجاد SH2 می کنند ،
تست اوره در سالمونلا منفی است.
تست IMVIC در مورد سالمونلا تیفی و پاراتیفی A به صورت – – + – و در سالمونلا پاراتیفی B و C به صورت + – + – است ، از راست به چپسالمونلا تیفی در صورت مزمن شدن معمولا در کیسه صفرا کلونیزه شده و تکثیر پیدا میکند و از طریق مدفوع دفع میشود.
لذا در موارد مزمن میتوان سالمونلا را از کشت مدفوع جدا نمود. برای حصول نتیجه بهتر باید هنگام آزمایش از مسهل نمکی استفاده نمود تا کیسه صفرا تخلیه گردد.
تشخیص نهایی سالمونلا و تعیین سروتایپ های آن توسط تست های سرولوژی ( آگلوتیناسیون بر روی لام ) با استفاده از آنتی سرم های اختصاصی سالمونلا انجام میشود.
در موارد مشکوک به تب تیفوئیدی از خون بیمار جهت انجام کشت نمونه گرفته میشود و در عفونت های گاستروآنتریت نمونه مدفوع جهت کشت استفاده میشود.

آنتی ژن های سالمونلا
به طور کلی سه نوع آنتی ژن مختلف در سالمونلا وجود دارند که به نام های  K- H –O-  موردبررسی قرار میگیرند

آنتی ژنo  یاسوماتیک :
که به حرارت ۱۰۰ مقاوم است جنس آن لییو پلی ساکارید است و در سطح باکتری وجود دارد و غالبا در اواخر هفته اول بیماری آنتی بادی های ضد انتی ژن o  در سرم ظاهر می گردد که به تدریج تیتر آن ها افزایش می یابد و در هفته ششم پس از الودگی به حداکثر تیتر می رسند و سپس به تدریج کاهش  یافته پس از شش ماه تا یک سال به حداقل یا صفر می رسند وجود انتی بادی های صفر در سرم یک شخص مهمترین شاخص آلودگی اخیر و فعال در او می باشد
تیتر بالا تر از ۱/۸۰در مورد انتی ژن O  می تواند تیتر بیماری زا یاشد مشروط به آنکه در آزمایش بار دوم که به فاصله یک یا دوهفته انجام می شود این تیتر افزایش قابل ملاحظه داشته باشد .
آنتی ژن H  یاانتی ژن فلاژل که نسبت به حرارت ۶۰ درجه حساس است و مربوط به فلاژل (تاژک) باکتری است جنس این انتی ژن از پروتئین است این آنتی ژن در سوش های متحرک و جود دارد آنتی بادی های ضدH  غالبادر حدود دهمین تا دوازدهمین روز بیماری دور تر از انتی باد ی های ضدO در سرم بیمار ظاهر می گردند ولی به سرعت به تیترهای بالاتری در مقایسه  با انتی بادی های ضد O می رسند.
آنتی ژن H  یک آنتی ژن پروتئینی است انتی بادی بر علیه این نوع انتی ژن از کلاس IgG است واین  آنتی بادی ها ممکن است تا سالها در سرم باقی بمانند و وجود آنها دلیلی بر آلودگی اخیر و یک عفونت حاد نیست تیتر ۱/۶۰ به بالا در مورد آنتی بادیهای ضد H ارزش تشخیصی دارد پس از درمان یا واکسیناسیون این انتی بادی ها تاسالها در بدن قابل اندازه گیری هستند.

آنتی ژن Vi criraence یا K
این آنتی ژن مربوط به کپسول باکتری است  که به حرارت حساس است  انتی ژن vi   روی انتی ژن o  را می پوشاند و مانع از اگلوتیناسیون باکتری به وسیله انتی بادی ضد o  می شود باکتری هایی دارای انتی ژن vi  از ویرولانس بیمارزایی بیشتری برخوردارند . تیتر آنها از نظر تشخیص دارای اهمیت نیست زیرا پس از انتی بادی های ضد o وH در سرم بیمار ظاهر می شود وغالبا در اواخر هفته دوم بیمار شروع به افزایش میکند و تا ۱/۴۰ میرسد و درافراد ناقل تیتر ۱/۱۰و ۱/۲۰ علیه آنتی ژن vi    همچنان باقی می ماند.

تفسیر نتایج ویدال
تفسیر نتایج :
به طور کلی در تفسیر نتایج تست ویدال بایستی همواره واکنش های متقاطع ، عفونت قبلی – واکسیناسیون قبلی را در نظر گرفت
به طور کلی آنتی بادی های مر بوط به انتی ژن O زودتر از آنتی بادی های مربوط به آنتی ژن H  ایجاد شده و زود تر نیز ناپدید میشود به طوری که پس از هر ماه تا یک سال تیتر آن کاملا کاهش می یابد
تیتر بالای  Antio در سرم یک بیمار تب دار را می توان به عنوان نشانه ای از عفونت فعال دانست در حالیکه آنتی بادی های ضد  H پس از تشکیل سالها در سرم بیمار باقی می ماند بنابر این چنانچه در یک بیمار تیترAnti h مشاهده شد اهمیت و ارزش تیتر بالای  Anti o را ندارد  زیرا ممکن است فقط نشان دهنده برخورد سالمونلا در گذشته باشد و یا در اثر واکسیناسیون تیتر   Anti h بوجود آمده باشد  تا یکسال ممکن است در سالمونولوز فقط تیتر anti h بالارود ولی تیتر anti o  تغییر نکند
تیتر آنتی بادی درهفته اول بیمار برای انتی ژن O,Hاز۱/۴۰ تا۱/۱۶۰ فراتر نمیرود وبالا رفتن تیتر در هفته های بعد از نظر تشخیص بیماری بسیارمهم است بطورکلی درایران ازمایش های مثبت باتیتر کمتر از ۱/۸۰ارزش چندانی ندارد و باید ۲-۱ هفته بعد مجددا ازمایش صورت گیرد
ویروسهایی مانند E.B,V که باعث فعال شدن رده های مختلف سلولهای B   Polycoiond activation می شوند سبب ایجاد پاسخ مثبت کاذب می گردند.
در سیروز کبدی آنتی بادی ضدo , H  تولید میشود .
درمان با انتی بیوتیک ها کلرامفنیکل  موجب وقفه در آنتی بادی سازی می گردد . که پاسخ منفی کاذب خواهیم داشت در مواردی که نقص ایمنی وجود داشته باشد پاسخ منفی کاذب دیده خواهد شد.

ویدال
آزمایش ویدال برای تشخیص سرولوژی حصبه Typhoid و شبه حصبه Paratyphoid می باشد. که علت آن آلودگی با گونه سالمونلا از دسته باسیل های روده ای است این باسیل ها از راه دستگاه گوارش وارد بدن انسان می شوند و موجب پیدایش بیماری های زیر می شود :
۱- تبهای تیفوئیدی و پاراتیفوئیدی به نام تبهای روده ای معروف است.
۲- سپتی سمی و عفونت خون
۳- مسمومیت غذایی
باسیل های تیفوئید و پاراتیفوئید را می توان قبل از اینکه تست ویدال مثبت شود به ترتیب از خون , مدفوع و سپس ادرار جدا کرد. بتدریج که تیتر آنتی بادی بالا می رود کشت های مثبت میکروب نیز کمتر می شود. ۹۰ تا ۹۹% بیماران آزمایش ویدال آنها مثبت خواهد شد .
در آزمایش ویدال خود میکروب به عنوان آنتی ژن بکار می رفت و فقط آنتی بادی بر علیه فلاژل های میکروب یا آنتی ژنH اندازگیری شد. آنتی ژن ساختمانی O نیز شناخته شده و در بیماریزایی میکروب نشان داده شده . آنتی ژن H از جنس پروتئین بوده وآنتی کر ضد آن از کلاس IgG و آنتی ژن O بیشتر از جنس لیپو پلی ساکارید و آنتی کر ضد آن از کلاس IgM می باشد.
آنتی O در مدت سه ماه تا حداکثر شش ماه منفی می شود ولی آنتی H تا مدتها مثبت است.
آنتی ژن دیگری به نام Vi از جنس پلی ساکارید در باسیل های سالمونلا تیفی و پارا تیفی دیده می شود. آنتی بادی بر علیه آن از کلاس IgM است دیرتر از O وH ظاهر می شود .
تشخیص بیماری تب دار بر اساس آگلوتیناسیون فعال یا مستقیم می باشد.این آزمایشها به روش بطئی و لوله انجام می شود.
اگر بر روی لام سرمی مثبت کاذب و یا به عللی که ذکر شد منفی کاذب شد باید آزمایش را با روش لوله تکرار نمود.
مواد مورد نیاز:
سرم بیمار: سرم باید فاقد هر گونه ذرات و همولیز باشد.
آنتی ژن: این آنتی ژن ها رنگی می باشد و از مواد رنگی کریستال ویوله (کریستال بنفش) و سبز درخشان استفاده شده است. این آنتی زن ها دارای مواد ضد میکروبی مانند فنل یا فرمالین هستند.
برای آزمایش ویدال از آنتی ژن های سوماتیک O وH میکروبهای زیر استفاده می شود:
۱٫ سالمونلا تیفی گروه D
۲٫سالمونلا پاراتیفی گروه A
۳٫سالمونلا پاراتیفی گروه B
۴٫سالمونلا پاراتیفی گروه C
آنتی ژن O با حروف بزرگ و آنتی ژن Hبا حروف بزرگ نشان می دهند.
آنتی ژن های تست ویدال
روش انجام آزمایش
۱)ابتدا از سرم بیمار ۰٫۱CC از سمت چپ به طرف راست به ترتیب در هر یک از مربع های روی صفحه شیشه ای ردیف اول و دوم مقادیرCC 0.08 ,0.04,0.02,0.01,0.005 ریخته می شود.
۲)همین مقدار از سرم مثبت را در ردیف های سوم و چهارم واز سرم منفی در ردیف های پنجم وششم بریزید.
۳)سرم هر بیمار باید حداقل با آنتی ژن های OوHسه میکروب سالمونلا گروه A,B,Dآزمایش شود. در ردیفهای یک و سه وپنج یک قطره آنتی ژن Oودر ردیفهای دو و چهارو شش یک قطره آنتی ژن H بریزید. با اپلیکاتور مخلوط کرده.
۴)به مدت سه دقیقه روی روتاتور قرار می دهیم و از نظر آگلوتیناسیون بررسی می کنیم.
نتیجه آگلوتیناسیون را سریع می خوانیم زیرا به علت خشک شدن آنتی ژن و آنتی بادی وبهم چسبیدن مولکولهای آنتی ژن ممکن است به طور کاذب آزمایش مثبت شود.

آگلوتیناسیون لوله
تهیه رقت آنتی ژن :
در آزمایش ویدال ابتدا آنتی ژن سالمونلای مورد نظری که برای آزمایش به روش آگلوتیناسیون سریع استاندارد گردیده را با محلول سرم فیزیولوژی فرمله ( ۰/۵%) به نسبت ۱/۸ رقیق می نماییم

روش کار :
تعداد ده لوله را در جا لوله ای قرار داده و در لوله اول ۰/۹ و در کلیه لوله های بعدی ۰/۵ میلی لیتر سرم فیزیولوژی ( ۰/۹%) می ریزیم ، به لوله اول ۰/۱ میلی لیتر سرم مورد آزمایش را اضافه نموده و بعد از مخلوط نمودن آنها بوسیله پیپت ۰/۵ میلی لیتر از آن را به لوله دوم و ۰/۵ میلی لیتر از لوله دوم را به سوم و به ترتیب تا لوله نهم انتقال میدهیم. ضمنا ۰/۵ میلی لیتر مایع اضافی لوله نهم را دور میریزیم. به هریک از لوله ها ۰/۵ میلی لیتر از آنتی ژن رقیق شده و یا استاندارد شده برای روش لوله را اضافه نموده و بعد از هم زدن به شرح زیر در انکوباتور قرار میدهیم
آنتی ژن های فلاژل سالمونلا به مدت یک ساعت در ۵۰ درجه و یا سه ساعت در ۳۷ درجه سانتیگراد
آنتی ژن های سوماتیک سالمونلا به مدت ۱۶ ساعت در ۵۰ درجه و یا ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سانتیگراد
بعد از زمان انکوباسیون ، بوسیله نور فلورسنتی که در زمینه سیاهی بتابد درجه آگلوتیناسیون را با مقایسه شاهد (لوله دهم که دارای ۰/۵ میلی لیتر از آنتی ژن است) طوری ثبت مینماییم که علامت ++++ مشخص کننده صددرصد آگلوتیناسیون آنتی ژن با آنتی کر باشد
یا بعبارت دیگر هنگامیکه در ته لوله آگلوتیناسیون به خوبی مشاهده کردید و مایع لوله مانند سرم فیزیولوژی کاملا شفاف باشد.

کشت خون
برای کشت خون در حدود ۱۰ میلی لیتر از خون بیمار را در زمان تب گرفته و در محیط Tripticase Soy Broth تلقیح کرده برای مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری کنید و سپس به محیط کشت جامد منتقل کرده و توسط تست های بیوشیمیایی کلنی مشکوک را بررسی کنید.
در تب تیفوئیدی در ۹۰ درصد از موارد کشت خون در هفته اول بیماری مثبت است.

کشت ادرار
برای کشت ادرار باید ادرار را در دور ۲۵۰۰ تا ۳۰۰۰ g به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه سانتریفوژ کنید و سپس مایع رویی را دور ریخته  و به وسیله آنس از رسوب ته لوله نمونه برداری کنید.
در سطح پلیت های حاوی محیط کشت جامد و در محیط سلنیت F کشت داده و از کلنی های مشکوک جهت تست های بیوشیمیایی برای تشخیص سالمونلا استفاده نمایید.
نکات سالمونلا
تولید SH2 در سالمونلا تیفی به شکل حلقه یا لکه سیاه رنگ در حد فاصل قسمت شیب دار و بخش استوانه محیط کلیگر آیرون آگار دیده می شود.
سالمونلا تیفی روی محیط بیسموت سولفیت آگار کلنی های سیاه با جلای فلزی ایجاد میکند.
سالمونلا کلراسویس و پاراتیفی c از کشت خون جدا میگردند.
برای افتراق سالمونلا از سیتروباکتر از تست لایزین استفاده می شود.
تست لایزین دکربوکسیلاز

پاسخ دهید