معماری

آزمايش مايع مغزي نخاعي و شناسائي عوامل قارچي با تأكيد بر كريپتوكوكوس نئوفرمنس

مقدمه
علائم عمومي مننژيت‌هاي قارچي
مايع مغزي نخاعي (CSF) در اين بيماران معمولاً داراي منظره‌ي شفاف است. سطح پروتئين عموماً افزايش يافته است و ممكن است بيشتر از يك گرم در ليتر باشد. قند آن معمولاً پائين است. تعداد سلول‌ها در هر ميلي‌متر مكعب افزايش متوسطي دارد (از چندين عدد تا چند صد عدد).

 

آزمايش مستقيم ميكروسكپي
حداقل 10 ميلي‌ليتر از مايع CSF را سانتريفيوژ كرده و رسوب آن را مورد آزمايش مستقيم ميكروسكپي و كشت قرار مي‌دهند. گسترش مرطوب شامل آزمايش مستقيم يك قطره از رسوب، تهيه لام با مركب چين و رنگ‌آميزي‌ها شامل متيلن‌بلو، گرم، كالكوفلوروايت، گيمسا، گوموري متنامين سيلور و PAS مي‌باشد.

 

منظره ميكروسكپي از رسوب CSF در يك نگاه اجمالي

كريپتوكوكوس نئوفرمنس:

مخمرهاي كپسول‌دار (5 تا 10 ميكرون و با كپسول20 تا30 ميكرون قطر دارند). درمننژيت كريپتوكوكوسي عموماً منونوكلئرها غلبه دارند و مننژيت مزمن لنفوسيتيك ايجاد مي‌كنند. مخمرهاي جوانه‌دار كوچك (3 تا 5 ميكرون) بويژه اگر همراه با هايفي يا سودوهايفي ديده شود دلالت بر كانديدا مي‌كند. مننژيت حاد يا نوتروفيليك غالباً در مننژيت كانديدائي ديده مي‌شود. بايد توجه داشت كه كانديدا گلابراتا فقط شامل بلاستوكونيدي (2.5 تا 4.5 ميكرون) است. اندازه‌ي سلول‌هاي‌ مخمري هيستوپلاسما كپسولاتوم كوچك‌تر (2 تا 4 ميكرون) است. سلول‌هاي بلاستومايسس درماتيتيديس بزرگتر (8 تا 15 الي 30 ميكرون) مي‌باشند. در مننژيت ناشي از بلاستومايسس درماتيديس پلي مرفونوكلئرها غلبه دارند. هيستوپلاسما و بلاستومايسس در بافت معمولاً هايفي ندارند. در مننژيت قارچ‌هاي رشته‌اي نوتروفيل‌ها غلبه دارند. قارچ‌هاي رشته‌اي بيشتر موجب گرانولوما يا آبسه‌ي مغزي مي‌شوند تا مننژيت. در مننژيت ناشي از كوكسيديوئيدس ايميتيس ائوزينوفيل‌ها حضور دارند و مننژيت گرانولوماتوزي ايجاد مي‌كند.
عوامل قارچي ايجادكننده مننژيت:

كريپتوكوكوس نئوفرمنس، كريپتوكوكوس گتي، گونه‌هاي كانديدا، گونه‌هاي آسپرجيلوس، كوكسيديوئيدس ايميتيس، بلاستومايسس درماتيتيديس، هيستوپلاسما كپسولاتم، اسپوروتريكس شنكئي، پاراكوكسيديوئيدس برازيلينسيس و پني‌سيليوم مارنفئي و علل قارچي نادر شامل كلادوفيالوفورا بانتيانا، موكور، رودوترولا مي‌باشند.
علل زمينه‌اي: پيوند ارگان، شيمي درماني سرطان، بستري بودن در ICU، بيماران داراي اختلالات سيستم ايمني، سركوبي سيستم ايمني، بدخيمي‌هاي خوني (لوسمي، لنفوم)، درمان‌هاي كورتيكوستروئيدي، بيماري‌هاي التهابي (ساركوئيدوز)، نوزادان نارس، بيماران HIV مثبت.

 

كريپتوكوكوس نئوفرمنس
مايع نخاع شفاف و به ندرت زرد رنگ يا كدر است. تعداد لكوسيت‌ها افزايش دارد ولي معمولاً از 800 سلول تجاوز نمي‌كند. تعداد لنفوسيت‌ها اغلب بالا است اما گاهي نوتروفيل‌ها هم زياد مي‌شوند. پروتئين بين 40 تا 600 ميلي‌گرم درصد متغير است. ميزان قند پائين است (اغلب حدود 10 ميلي‌گرم درصد).
آزمايش ميكروسكپي با پتاس 10%، رنگ‌آميزي با گيمسا و استفاده از روش اختصاصي مركب چين (مخمرهاي گرد به قطر 5 تا 20 ميكرون، اتصال نقطه‌اي جوانه به سلول مادر، كپسول ضخيم ژلاتيني) براي تشخيص ارگانيسم صورت مي‌گيرد. بجز گونه‌هاي غيرعادي كليه مخمرهاي جنس كريپتوكوكوس مخمرهائي بدون رشته، كپسول‌دار و بدون رنگدانه كاروتنوئيد هستند. انواع كريپتوكوكوس‌ها اوره‌آز مثبت هستند و در محيط حاوي اوره با ايجاد كربنات آمونيوم (قليائي) رنگ محيط را بعد از چهار روز قرمز مي‌كنند. كريپتوكوكوس‌ها عمدتاً هيچيك از قندها را تخمير نمي‌كنند. حساسيت آنها در مقابل اكتيديون متغير است. (بطور كلي 0.1 ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر از رشد كريپتوكوكوس در محيط كشت جلوگيري مي‌كند). همچنين توليد آنزيم فنل اكسيداز مي‌كنند.

 

تشخيص آزمايشگاهي مننژيت كريپتوكوكوسي در بيماران ايدزي:
تعداد زياد ارگانيسم در CSF اين بيماران موجب مثبت شدن آزمايش مستقيم ميكروسكپي با مركب چين مي‌شود (70 تا 90% موارد نتيجه مثبت است). توضيح اينكه درآزمايش مركب چين هنگامي كه تعداد سلول در هر ميلي‌ليتر بين 1000 تا 10.000 باشد نتيجه مثبت خواهد بود. در بيماران ايدزي اين ميزان برابر 100.000 الي 10.000.000 سلول است. لكوسيت‌ها، قطرات چربي، سلول‌هاي بافتي و گلبول‌هاي ميلين ممكن است با اشتباه گرفتن با عناصر مخمري موجب نتيجه مثبت كاذب در آزمايش مركب چين گردند. سانتريفيوژ كردن نمونه با دور 500 در دقيقه بمدت 10 دقيقه حساسيت اين تست را افزايش مي‌دهد. (casadevall, 1998). تعداد گلبول‌هاي سفيد كاهش دارد و يا ممكن است نرمال باشد.
تشخيص آزمايشگاهي مننژيت كريپتوكوكوسي در بيماران غيرايدزي:
آزمايش مركب چين تقريباً در 50% بيماران مثبت است. تعداد گلبول‌هاي سفيد مايع نخاع افزايش نشان مي‌دهد و اكثراً از نوع لنفوسيتي هستند.

 

كشت:
معمولاً در مدت 48 تا 72 ساعت رشد مي‌كند. دماي مطلوب براي رشد آن 30 تا 35 درجه است هرچند كه در 37 درجه سانتي‌گراد نيز رشد مي‌كند. (سابورو دكستروز آگار محتوي كلرامفنيكل، محيط خوندار و BHI). در مقابل حرارت بسيار حساس است و در دماي 40 تا 42 درجه رشد نمي‌كند. كلني‌هاي سفيد خامه‌اي با هاله‌اي صورتي ظاهر مي‌شود كه بعد از 5 تا 8 روز سطح كلني‌ها صاف، مرطوب و موكوئيدي شده و به رنگ گل اخرا در مي‌آيند. كشت از حجم زياد CSF و تكرار نمونه‌گيري مي‌تواند كمك‌كننده باشد. محيط كشت اختصاصي birdseed agar است كه محتوي تركيبات دي‌فنوليك بوده و Cryptococcal laccase موجب تشكيل ملانين و در نتيجه ظهور كلني‌هاي قهوه‌اي رنگ مي‌شود.
از محيط كشت اختصاصي Concanavine-glycin thymol blue agar براي تشخيص افتراقي كريپتوكوكوس نئوفرمنس از كريپتوكوكوس گتي استفاده مي‌شود. (زمان انكوباسيون اين محيط 5 روز در دماي 30 درجه مي‌باشد). در اين محيط كريپتوكوكوس گتي رنگ سبز محيط كشت را به رنگ آبي تبديل مي‌كند. بايد توجه داشت كه مخمرهاي ديگري نظير كريپتوكوكوس لورنتي (C. laurentii) و تريكوسپورون موكوئيدس نيز مي‌توانند موجب تغيير رنگ اين محيـــــــــــــط كشت شوند (CGB- positive)، اما هردو اين مخمرها از نظر توليد ملانين منفي هستند. بنابراين تست CGB فقط براي تشخيص افتراقي كريپتوكوكوس گتي از كريپتوكوكوس نئوفرمنس مفيد است. در يك مطالعه از 149 بيمار HIV منفي مبتلا به مننژيت 89% آنها كشت مثبت داشته اند. (pappas, 2001) در بيماران ايدزي اين ميزان برابر 95 تا 100% بوده است. (zugen, 1986 & Kovacs, 1985). آزمايش مستقيم و كشت اختصاصي هستند ولي داراي ميزان حساسيت برابر با 50 تا 80 درصد مي‌باشند.

سرولوژي:
اندازه‌گيري آنتي‌بادي سودمند نيست. اندازه‌گيري آنتي‌ژن كريپتوكوكال تست سريع و ساده‌اي است. آزمايش آگلوتيناسيون لاتكس و الايزا داراي حساسيت بيش از 90% (در بعضي گزارش‌ها حساسيت آگلوتيناسيون لاتكس 85% و حساسيت الايزا را حدود 805 ذكر كرده‌اند) و تيتر بيشتر از يك چهارم (4/1) بسيار اختصاصي است. تيتر مساوي يا بيشتر از 8/1 نشان‌دهنده‌ي عفونت فعال است. در بيماران HIV مثبت بدون علامت، با كمك اين تست مي‌توان تشخيص سريع و زودرس انجام داد.
چند نمونه از تحقيقاتي كه در آنها حساسيت آزمايش آگلوتيناسيون لاتكس مطالعه شده است:
در 16 مورد مننژيت كريپتوكوكي (kovacs, 1985) 100%

در 26 مورد مننژيت كريپتوكوكي (zugen, 1980) 92%

در 88 مورد مننژيت كريپتوكوكي (chuck, 1989) 91%

در 40 مورد مننژيت كريپتوكوكي (clark, 1990) 92.5%

در افراد HIV منفي: در ساير بيماران بويژه افراد داراي ايمني شايسته، كشت و آزمايش آنتي‌ژن CSF گاهي اوقات منفي و در نتيجه تشخيص مشكل است.

 

علل بروز واكنش مثبت كاذب در تست آگلوتيناسيون لاتكس:
فاكتور روماتوئيد
كانسر (بسيار ضعيف)
عفونت مربوط به تريكوسپورون (آنتي‌ژن پلي‌ساكاريدي كپسولي شبيه كريپتوكوك توليد مي‌كند)
عفونت مربوط به Stomatococcus mucilaginosis(آنتي‌ژن كپسولي توليد مي‌كند كه واكنش متقاطع با كپسول كريپتوكوك مي‌دهد)
عفونت با Capnocytophaga canimorsus

آلودگي با ابزارهاي آزمايشگاهي (during pippeting )

آلودگي به هنگام استفاده از مواد ضدعفوني كننده و صابون براي تميز كردن اسلايدها، آلودگي با آگار و آگارز

براي جلوگيري از واكنش‌هاي ناخواسته:

نمونه‌ها بايد با آنزيم‌هاي پروتئوليتيك مانند پروناز آماده‌سازي شوند و با 2- بتا مركاپتواتانول يا دي تيوتريتول احياء شوند.
واكنش‌هاي منفي كاذب ممكن است بعلت اثر پروزون، عفونت با يك استرين با كپسول بسيار ضعيف، بار پائين ارگانيسم در نمونه و يا مشكلات مربوط به كيت ديده شوند.

 

مننژيت آسپرجيلوسي
از طريق دستگاه تنفس و سينوس‌هاي اطراف بيني وارد بدن مي‌شود. تهاجم به سيستم اعصاب مركزي بوسيله‌ي تلقيح مستقيم به نواحي كه به لحاظ آناتوميك نزديك مغز هستند و يا بوسيله‌ي انتشار هماتوژنوس صورت مي‌گيرد. علاوه بر عفونت اوليه در ريه‌ها، انتشار خوني بوسيله‌ي تلقيح مستقيم به داخل جريان خون از طريق گوش مياني، سينوس‌هاي اطراف بيني، چشم و ماستوئيد و يا در نتيجه‌ي عمل جراحي قلب باز اتفاق مي‌افتد. آسپرجيلوس فوميگاتوس و آسپرجيلوس فلاووس از عوامل شايع هستند. آسپرجيلوس ترئوس اگرچه يك عامل غيرمعمول تهاجم به سيستم اعصاب مركزي است اما به لحاظ مقاومت به آمفوتريسين B داراي اهميت است و مرگ‌ و‌ مير بالائي دارد.

 

اقدامات آزمايشگاهي:
آماده‌سازي نمونه: نمونه CSF به مدت 10 دقيقه با دور 10000 سانتريفيوژ شود.
رسوب: براي آزمايش ميكروسكپي از روش رنگ‌آميزي گرم و متيلن بلو و كالكوفلور وايت استفاده شود.
كشت: در محيط سابورو دكستروز آگار محتوي 10% كلرامفنيكل و آبگوشت سابورو تلقيح شده و محيط آبگوشتي را در دماي 30 درجه سانتي‌گراد به مدت 3 هفته نگهداري مي‌نمايند. كشت‌هاي مثبت هنگامي بدست مي‌آيند كه حجم زيادي از نمونه به محيط كشت تلقيح شود (ترجيحاً 5 ميلي‌ليتر و بيشتر).
سرولوژي:

اندازه‌گيري آنتي‌ژن اختصاصي آسپرجيلوس (گالاكتومانان) در سرم و مايع مغزي نخاعي توسط ساندويچ الايزا به تشخيص كمك مي‌كند.

نحوه انجام آزمايش بر روي نمونه CSF از نظر عوامل قارچي (با تأكيد بر كريپتوكوكوس نئوفرمنس)
توجه:

تا قبل از انجام كشت نمونه نبايد در يخچال قرار گيرد زيرا استرين‌هاي كريپتوكوكوس نسبت به دماي پائين حساس بوده و از بين مي‌روند.
– ابتدا نام و مشخصات بيمار بدقت ثبت شود.
– حجم نمونه اندازه‌گيري و ثبت شود.
– رنگ و ميزان شفافيت يا كدورت نمونه بدقت ثبت شود.
– تمام نمونه بمدت 15 دقيقه با دور 1000 سانتريفوژ شود.
– مايع روئي به لوله استريل ديگري براي انجام تست‌هاي سرولوژيك منتقل شود.
از رسوب نمونه (pellet) آزمايش مستقيم ميكروسكپي و كشت انجام مي‌شود. ابتدا رسوب را خوب به هم زده تا مخلوط همساني بدست آيد، سپس:
الف- آزمايش‌هاي ميكروسكپي از رسوب:
1- آزمايش مستقيم ميكروسكپي:
هدف: بررسي وجود يا فقدان عناصر قارچي (هايفي كاذب و مخمرهاي جوانه‌دار) و آميب‌هاي آزادزي (Amphizoic Amoeba) مانند نگلريا و آكانتاموبا.
روش كار:

تهيه لام مرطوب بصورت مستقيم با برداشت يك قطره از رسوبي كه خوب مخلوط شده‌است و قرار دادن آن روي لام و مشاهده ميكروسكپي با عدسي 10 و 40. وضعيت گلبول‌هاي قرمز و سفيد نيز در اين آزمايش از نظر فراواني در نظر گرفته مي‌شود.
2- تهيه لام با مركب چين:

يك قطره از رسوب CSF را روي لام قرار داده و به آن يك قطره مركب چين (كه حجم آن يك سوم حجم قطره‌ي برداشت شده از مايع CSF باشد) افزوده و بعد از مخلوط كردن با عدسي 10 و 40 بررسي مي‌كنيم. در صورت وجود سلول‌هاي مخمري كپسول‌دار اطراف اين سلول‌ها هاله‌ي ضخيم و شفافي ديده مي‌شود و با عدسي 10 منظره شبيه آسمان سياه پرستاره مشاهده مي‌گردد. برخي از استرين‌هاي كريپتوكوك فاقد كپسول و يا برخي ممكن است داراي كپسول ظريفي باشند. مخمرهاي كپسول‌دار در CSF حدود 60درصد بيماران مبتلا ديده مي‌شود. حساسيت اين آزمايش را از 60% تا 72% گزارش كرده‌اند.
توجه : براي تهيه لام جهت رنگ‌آميزي‌هاي زير ابتدا لام را به صورت زير تهيه كنيد:
يك قطره درشت از رسوب را روي لام قرار داده و بدون اينكه آن را پهن كرده يا بگسترانيد اجازه دهيد در مجاورت هوا خشك شود. بعد از خشك شدن يك قطره‌ي ديگر به همين شكل روي قطره‌ي خشك شده ريخته و مجدداً اجازه دهيد تا در مجاورت هوا خشك شود. سپس لام را با كمك حرارت مختصر و يا بكمك متانول فيكس نموده و رنگ‌آميزي‌هاي زير را انجام دهيد. (به اينصورت يك گسترش نسبتاً ضخيم و پرسلول حاصل خواهد شد كه مشاهده و بررسي ميكروسكپي آن سريع‌تر و دقيق‌تر خواهد گرديد).
3- رنگ‌آميزي گيمسا يا رايت گيمسا:

از همان دستورالعمل رنگ‌آميزي براي هماتولوژي استفاده مي‌شود. هدف بررسي وضعيت گلبول‌هاي سفيد از نظر برتري حضور منونوكلئرها يا پلي‌نوكلئرها و نيز مشاهده احتمالي سلول‌هاي مخمري مي‌باشد.
4- رنگ‌آميزي گرم:

هدف بررسي وجود احتمالي عناصر باكتريال و نيز سلول‌هاي مخمري مي‌باشد.

 

5- رنگ‌آميزي كانيون:

براي بررسي وجود احتمالي باكتري‌هاي رشته‌اي نظير نوكارديا مي‌باشد.
ب- كشت از رسوب در محيط‌هاي زير انجام گيرد:
سابورودكستروز آگار، سابورو كلرآمفنيكل‌دار، BHI و انكوباسيون در دماي آزمايشگاه يا 30 درجه سانتي‌گراد به مدت 2 تا 5 روز
محيط ژلوز خوندار و انكوباسيون در 37 درجه سانتي‌گراد و محيط ژلوز شكلاتي و انكوباسيون در شرايط 5 تا 10 درصد گاز كربونيك و 37 درجه سانتي‌گراد به مدت 2 تا 5 روز
محيط كشت Lowenstein-Jensen: كشت از نظر AFB در هر نمونه بايد صورت گيرد. اين كشت‌ها تا يكماه بايد در شرايط 37 درجه سانتي‌گراد. نگهداري شوند.

 

توضيحات:
ميزان حساسيت كشت را حدود 56% گزارش مي‌كنند. كشت حجم زيادي از نمونه و در بعضي موارد كشت نمونه‌هاي متعدد حساسيت كشت را افزايش مي‌دهد.
پليت‌هاي حاوي محيط‌هاي كشت فوق را بايد روزانه از نظر رشد بررسي و تا 3 هفته نگهداري كرده و در صورت عدم رشد بعد از 3 هفته منفي تلقي نمود. رشد هرگونه كلني با رنگ‌آميزي گرم مورد بررسي قرار گيرد و در صورت مشاهده سلول‌هاي مخمري رنگ‌آميزي كپسول (مركب چين و يا رنگ نيگروزين10%) انجام شود.
كريپتوكوكوس نئوفرمنس معمولاً ظرف 2 تا 3 روز بصورت كلني‌هاي كرم رنگ سفيد تا زرد مايل به قهوه‌اي ظاهر مي‌شوند. استرين‌هاي كپسول‌دار كلني‌هاي براق و درخشاني را ايجاد مي‌كنند و استرين‌هائي كه فاقد كپسول بوده يا كپسول ضعيفي دارند خشك به نظر مي‌رسند.
ممكن است بعد از 24 الي 48 ساعت كلني‌هاي سفيد خامه‌اي با هاله‌ي صورتي ظاهر شوند كه بعد از 5 تا 8 روز بصورت كلني‌هاي صاف، مرطوب و موكوئيدي به نظر برسند. در محيط سابورو مالتوز آگار كلني‌ها رنگ گل اخرا به خود مي‌گيرند.
در محيط EMB بعد از يك هفته بصورت مرطوب و سيال در مي‌آيند.
در صورت رشد كلني‌هاي مخمري مشكوك به كريپتوكوكوس نئوفرمنس به منظور تأئيد حداقل مي‌توان از تست‌هاي زير كمك گرفت:
تست هيدروليز اوره در محيط chrisensen’s urea agar (نتيجه مثبت است)
تست احياء نيترات (نتيجه منفي است)
تست فنل اكسيداز (نتيجه مثبت است)

 

با توجه به اينكه رنگ‌آميزي‌هاي گرم و گيمسا بيشتر متداول مي‌باشند در اينجا فقط به شرح جزئيات روش رنگ‌آميزي كانيون بسنده مي‌شود:

 

روش رنگ‌آميزي كانيون (زيل‌نلسون اصلاح شده)

 

هدف:

براي رنگ‌آميزي باكتري‌هاي اسيدفست مانند مايكوباكتريوم‌ها و نيز باكتري‌هاي اسيدفست نسبي يا اسيدفست ضعيف مانند نوكاردياها مي‌باشد.
نكته: استفاده از رنگ كربول فوشين carbolfuchsin) ) در اين رنگ‌آميزي به دليل اينكه داراي غلظت بيشتري از فنل و فوشين بازيك است نيازي به حرارت دادن (مانند زيل نلسون كلاسيك) ندارد.

 

روش رنگ‌آميزي:
1- رنگ كانيون كربول فوشين را روي لام بريزيد و 5 دقيقه صبر نمائيد.
2- شستشوي كامل با آب
3- اسيد الكل (اسيدكلريدريك 3% در اتانول) به مدت 3 دقيقه روي لام قرار دهيد.
4- شستشوي كامل با آب
5- رنگ متيلن بلو به مدت 3 دقيقه روي لام بماند.
6- شستشوي كامل با آب
7- لام را خشك كرده و با عدسي روغني ميكروسكوپ مشاهده كنيد.
نكته

1- اسيدكلريدريك 3% كه در محلول اسيد الكل وجود دارد براي مايكوباكتريوم‌ها مناسب است. اگر هدف بررسي و مشاهده نوكاردياها باشد بهتر است در تركيب اسيد الكل به عوض اسيدكلريدريك از اسيد سولفوريك 1% استفاده شود.
نكته

2- در اين رنگ‌آميزي باكتري‌هاي اسيدفست قرمز و باكتري‌هاي غيراسيدفست آبي رنگ مي‌گيرند.

 

نویسنده:دكتر محمد قهري
منابع مورد استفاده:
1- Diagnostic Bacteriology: A study guide, Margaret A, Bartelt 2000, F. A. Davis Company
2- Saha, D.C , Xess I. , Jain N. Evaluation of conventional and serological methods for rapid diagnosis of cryptococcosis. Indian J Med Res 127, 2008, pp:483-88.
3- www.doctorfungus.org/mycoses/human/crypto/crypto_index.php