تشخیص افتراقی گونههای کاندیدا
از آنجائی که اغلبِ مخمرها از اعضاء فلور طبیعیِ سطح پوست، مخاط دهان، روده و واژن میباشند، اکثر آزمایشگاهها تعیین هویت مخمرهائی که از کشت نمونهها جدا میشوند را ضروری نمیدانند. باید توجه داشت که بدلیل افزایش موارد جداسازی گونههای غیر آلبیکنسی از نمونههای مختلفِ کلینیکی و شیوع و بروز مقاومتهای داروئی در برخی گونهها و نیز بدلیل انجام مطالعات و بررسیهای اپیدمیولوژیکی و بیمارستانی، امروزه تعیین جنس و گونه مخمرها ضروری مینماید. از جمله در موارد مشروح زیر تعیین هویت مخمرها در سطح گونهای الزامی است:
۱- مخمرهای جدا شده از بافتهای بیوپسی شده، خون، مایع مغزی نخاعی و سایر مایعات استریل بدن.
۲- مخمرهائی که به تعداد زیاد از نمونههای بالینی جدا شدهاند.
۳- مخمرهائی که به کرات از بیماران مبتلا به اختلالات سیستم ایمنی و یا کسانی که مشکوک به عفونتهای قارچی هستند، جدا شدهاند.
برای تعیین هویت مخمرها از شاخصهای ویژهای استفاده میشود که از آن جمله میتوان از شکل ظاهری کلنی، اشکال میکروسکپی ایجاد شده در محیط کورن میل- توئین ۸۰ آگار، الگوی جذب کربن با استفاده از تکنیکها و روشهای متنوع، وجود برخی از آنزیمها نظیر اورهآز و فنیل اکسیداز (کشت بر روی محیط ژلوز دانههای نایجر) و ایجاد آسکوسپور و یا کشت در محیطهای کشت کروموژنیک نام برد. روشها و تکنیکهای مختلف بیولوژی ملکولی که از دهههای اخیر شروع شده همچنان بصورت روزافزون در شناسائی و تعیین گونههای کاندیدا جایگاه ویژهای پیدا کرده که خود نیاز به بحثهای مستقل و مستمری دارد.
کاندیدا آلبیکانس و گونههای شایع غیر آلبیکنسی در یک نگاه
نکات عملی و قابل توجه |
۱- عفونت کاندیدائی که با آن برخورد کردهاید ممکن است ناشی از کاندیدا آلبیکانس نباشد. ۲- مقاومت به مواد ضد قارچی آزولی در حال افزایش است. ۳- مراقبین بهداشتی معمولاً ناقلین مخمرها بوسیله دستهایشان هستند. |
کاندیدا آلبیکنس یک قارچ دیپلوئید، دیمورفیک و با تولید مثل غیرجنسی است که در محیط زندگی انسان و نیز در سطوح پوششی بدن وی (پوست و مخاطها) وجود دارد. هنوز علت اینکه چرا این ارگانیسم کومنسال معمولی گاهی اوقات پاتوژن میشود را نمیدانیم اما آسیب مکانیسمهای دفاعی میزبان در این رابطه نقش اساسی دارد. تعدادی از فاکتورهای ویرولانس قارچی توسط محققین بخوبی بررسی شده است اما مهمترین آنها ظاهراً مربوط به چسبندگی قارچ به سطوح و مخاطها است. بوسیله تایپینگ مولکولی استرینهای جدا شده نشان داده شده است که مراقبین بهداشتی معمولاً مخمرها را بین بیماران بوسیله دستهایشان منتقل میکنند. گونههای کاندیدا از ۱۵ الی ۵۴ درصد دستهای این افراد در بخشهای مراقبت ویژه جدا شده است.
چگونه کاندیدا آلبیکانس را از سایر گونهها تشخیص دهیم؟
تشخیص کاندیدا آلبیکانس از سایر گونهها با کمک مشخصات مرفولوژی، بیوشیمی، تست جرم تیوب و تکنیکهای ملکولی صورت میگیرد.
- مرفولوژی: کشت در محیط کورن میل آگار صورت میگیرد. کاندیدا آلبیکنس در این محیط بعد از ۳ روز تولید کلامیدوکونیدی میکند. تولید سودوهایفی بدون کلامیدوکونیدی نشان دهنده گونههای دیگر کاندیدا است. تولید آرتروسپور نشان دهنده تریکوسپورون است. کاندیدا گلابراتا در محیط کورن میل آگار فقط بلاستوسپور ایجاد میکند.
کلنیهای کاندیدا آلبیکنس در محیط گلوکز پپتون آگار در دمای ۳۰ درجه به رنگ سفید یا کرم، صاف و براق یا گاهی اوقات ناصاف و مات دیده میشود و این اشکال در تشخیص چندان کمک کننده نیستند.
کاندیدا تروپیکالیس نیز نمای مشابهی دارد (هایفی حقیقی دارد اما فاقد کلامیدوسپور است)، ممکن است بلاستوسپور در فواصل بین سلولهای هایفی دیده شود. در تشخیص افتراقی آن از کاندیدا آلبیکنس تستهای بیوشیمی کمک کننده است.
کاندیدا تروپیکالیس سوکروز را تخمیر میکند.
کاندیدا دوبلینینسیس از لحاظ مرفولوژیک و بیوشیمیائی بسیار شبیه کاندیدا آلبیکنس است و برای تفکیک این دو یا باید از چندین تست بیوشیمیائی یا فیزیولوژیکی استفاده کرد و یا اینکه از روش ملکولی (PCR-RFLP) سود جست.
کاندیدا کروزئی هایفی حقیقی ندارد اگرچه سودوهایفی که تولید میکند ممکن است بسیار شبیه هایفی حقیقی باشد. این قارچ بلاستوسپورهای بیضی شکل تولید میکند.
کاندیدا لوزیتانیا سودوهایفی دراز با شاخههای جانبی کم و بلاستوسپورهای فراوان و بیضوی کوچک تولید میکند. جذب رامنوز از ویژگیهای بارز این قارچ است.
کاندیدا پاراپسیلوزیس دارای سودوهایفی است که اغلب به یک سلول متورم منتهی میشود و گاهگاهی بلاستوکونیدیهای نسبتاً گرد نیز دیده میشوند.
کاندیدا گلابراتا سودوهایفی تشکیل نمیدهد و به همین دلیل قبلاً آن را بعنوان تورولوپسیس میشناختند. دارای بلاستوکونیدی گرد تا بیضی کوچک میباشد. (کاندیدا فاماتا و کاندیدا اینکونسپیکوزا و ساکارومایسس سرویسیه شبیه یکدیگر و مشابه این قارچ هستند).
کاندیدا گیلرموندی و کاندیدا گلابراتا برای رشد به انکوباسیون طولانیتری نیاز دارند.
کاندیدا تروپیکالیس، کاندیدا پاراپسیلوزیس و کاندیدا کروزی نسبت به سیکلوهگزامید حساس هستند.
- بیوشیمی: با استفاده از تست تخمیر قندها میتوان به یک تشخیص احتمالی سریع دست یافت. البته این تست به تنهائی کافی نیست و در کنار آن از مرفولوژی قارچ نیز همیشه باید کمک گرفت.
- تست سرمی جرم تیوب: یک تست سریع و پیشنهادی برای کاندیدا آلبیکنس است. روش انجام آن بدین صورت است که مقدار بسیار کمی از کلنی مخمری را در سرم اسب و در دمای ۳۷ درجه بمدت ۲ تا ۳ ساعت انکوبه کرده سپس با استفاده از اسلاید میکروسکپی (لام مرطوب) چنانچه هایفیهای کوتاه که طول آنها بیش از دو برابر قطر سلول مخمر اولیه باشد مشاهده شوند، نتیجه تست مثبت میباشد. نتایج منفی کاذب هم دیده میشود.
- تکنیکهای ملکولی: روشهای ملکولی مختلفی از قبیل PCR، PCR-RFLP، تعیین توالی اسیدهای نوکلئیک ژنومی و غیره برای شناسائی سریع و دقیق گونههای کاندیدا وجود دارند.
***
در این بخش به روشهای معمول و سنتی برای شناسائی گونهها که در تمامی آزمایشگاهها قابلیت اجراشدن را دارند اشاره میشود.
شکل ظاهری کلنیهای مخمری:
کلنیهای مخمری از نظر رنگ، سفید تا کرم، کرم متمایل به زرد، زرد متمایل به نارنجی، نارنجی و قرمز رنگ میباشند. بسته به شرائط غذائی و نگهداری، حاشیه یا مرز میسلیالی ممکن است در اطراف کلنی بعضی از گونهها ایجاد گردد. گرچه ظاهر کلنیهای مخمری در گونههای مختلف برعکس قارچهای میسلیال (کپکی) تفاوت چندانی با یکدیگر ندارند، ولی ایجاد رنگدانه یکی از ویژگیهای مهم در تعیین هویت آنها است. در صورتی که رنگ کلنی مخمری نارنجی تیره تا قرمز باشد، میتوان تعدادی از مخمرهای فوقالعاده پاتوژن مانند کریپتوکوکوس نئوفرمنس، انواع کاندیدا، مالاسزیا، گونههای ترایکوسپورون و شکل مخمری قارچهای دوشکلی (دیمورفیک) را کنار گذاشت. اگر کلنی به رنگ کرم یا کرم تیره و شدیداً موکوئید باشد، پاتوژنی که بیشتر محتمل است، کریپتوکوکوس نئوفرمنس بوده و بدین ترتیب میتوان کاندیدا آلبیکنس و یا انواع دیگر کاندیداهای پاتوژن را از لیست عوامل احتمالی حذف کرد.
دمای رشد (کشت):
برای مقایسه درجه رشد کشتهای مخمری نمیتوان از استریک (streak) کردن یک آنس از مخمر مورد نظر برروی محیط کشت موجود در لوله یا پلیت استفاده کرد زیرا مقدار زیاد مواد تلقیح شده موجب اشتباه در خواندن نتیجهی رشد خواهد شد، بنابراین بهتر است ابتدا از سلولهای مخمری سوسپانسیونی در سرم فیزیولوژی تهیه کرده و یک آنس از سوسپانسیون فوق را روی آگار موجود در لوله یا پلیت و در دو سری استریک نمود. یک سری را در دمای ۳۰ درجه و سری دیگر را در دمای ۳۷ درجه نگهداری کرده و سپس در مدت ۲ تا ۳ روز میزان رشد را در درجات حرارت مختلف مقایسه کرد.
شکل میکروسکپی:
اشکال میکروسکپی ساختمانهای جنسی و غیرجنسی، اطلاعات کلیدی را برای تشخیص جنس مخمرها در اختیار ما میگذارند. برای مشاهده ساختمانهای غیرجنسی، اغلب در آزمایشگاههای بالینی از ژلوزهای کورن میل فاقد و یا حاوی توئین ۸۰ استفاده میشود. مشاهده و یا عدم مشاهده هایفا، سودوهایفا، بلاستوکونیدیا وآرتروکونیدیا مشخصات کلیدی هستند که برای تشخیص جنس مخمرها بکار میروند؛ بعنوان مثال اغلب گونههای کاندیدا را میتوان از گونههای کریپتوکوکوس و ترایکوسپورون توسط داشتن سودوهایفا و فقدان آرتروکونیدیا تشخیص داد. اندازه و شکل بلاستوکونیدیا و وجود کپسول از مشخصات مهمی هستند که در تشخیص جنس مخمرها بکار میروند، مثلاً کاندیدا گلابراتا و کریپتوکوکوس نئوفرمنس هر دو فاقد هایفا و یا سودوهایفا بوده ولی در عین حال به راحتی میتوان بلاستوکونیدیهای کوچک، بیضی شکل و بدون کپسول کاندیدا گلابراتا را از سلولهای گرد، بزرگ و کپسول دار کریپتوکوکوس نئوفرمنس تشخیص داد. در مورد کاندیدا آلبیکنس تعیین هویت گونه در اغلب موارد از روی شکل میکروسکپی و بدون نیاز به تست جذب کربن صورت گرفته و تنها به مشاهده تشکیل لوله زایا در سرم و یا تولید کلامیدوسپور بر روی ژلوز کورن میل توئین ۸۰ اکتفا میشود. مشخصات اصلی ساختمانهای جنسی که در
تشخیص جنس مخمرها مورد استفاده میباشند عبارت از شکل آسکوسپور، تعداد و ویژگیهای دیواره آسکوسپور میباشد. آسکوسپورها بوسیله رنگآمیزی اسیدفست به راحتی قابل تشخیص هستند. معمولترین روش رنگآمیزی برای آسکوسپورها روش تغییر یافته مالاشیت گرین و سافرانین است که آسکوسپورهای بالغ به رنگ آبی متمایل به سبز و سلولهای زایا به رنگ قرمز مشاهده میشوند.
تست لوله زایا برای تشخیص کاندیدا آلبیکنس
این تست یکی از ابتدائیترین روشهای تشخیصی کاندیدا آلبیکنس است. ۹۰ درصد ایزولههای کلینیکی کاندیدا در صورتیکه درون سرم تازهی انسان و بمدت ۲ تا ۳ ساعت در دمای ۳۷ درجه نگهداری شوند، ایجاد لوله زایا مینمایند. لولههای زایا هایفیهای کوتاه و ابتدائی هستند که مستقیماً از سلولهای مخمری جدا میشوند. گاهی در شرائط مشابه، آرتروکونیدیاهای ژئوتریکوم و ترایکوسپورون ایجاد لولههای طویلی را مینمایند که با لولههای زایای کاندیدا آلبیکنس مشابهت دارند ولی به هر حال کاندیدا آلبیکنس اولاً سلولهای جوانهزن فعال را نیز علاوه بر لولههای زایا ایجاد مینماید و ثانیاً فاقد آرتروکونیدیا و میسلیوم حقیقی بوده و بدین ترتیب از دو قارچ مذکور افتراق داده میشود. مانند سایر آزمایشها مقدار مخمر تلقیحی، محیط کشت مصرفی و درجه حرارت انکوباسیون در نتایج بدست آمده مؤثر هستند. سرم انسان یا حیوانات آزمایشگاهی برای انجام آزمایش مناسب میباشند ولی بعلت احتمال وجود ویروسهای بیماریزا در سرم انسانی توصیه شده است که از سرم گوساله و یا سرم اسب استفاده شود. بالاترین میزان تولید لوله زایا در صورتی است که میزان ارگانیسم تلقیح شده در سرم، به تعداد یکصد هزار یا یک میلیون سلول در هر میلیلیتر باشد. اگر تعداد سلولها زیاد گردد، ایجاد لوله زایا کاهش خواهد یافت. میتوان از واریتههائی از کاندیدا آلبیکنس که ایجاد لوله زایا میکنند بعنوان شاهد مثبت و از کاندیدا تروپیکالیس بعنوان شاهد منفی در طی آزمایش استفاده نمود. یکی از سادهترین روشهای انجام این تست در زیر شرح داده شده است:
- توسط یک آنس استریل از کشت خالص مخمر برداشت کنید.
- سوسپانسیونی از مخمر در درون سرم گوساله، گاو، خرگوش یا انسان تهیه نمائید، بطوریکه حجم آن ۳/۰ تا ۵/۰ میلیلیتر بوده و حاوی حدود ۱۰۰ الی ۱۰۰۰ سلول باشد.
- سوسپانسیون فوقالذکر را در دمای ۳۷ درجه به مدت ۲ تا ۳ ساعت نگهداری نمائید.
- توسط یک آنس استریل یک قطره از سوسپانسیون فوق را روی یک لام استریل گذاشته و پس از پوشاندن آن توسط لامل، وجود یا فقدان لوله زایا را در زیر میکروسکوپ بررسی نمائید.
آشنائی با مشخصات کلنی و منظره میکروسکپی گونههای شایع کاندیدا
۱ – کاندیدا پاراپسیلوزیس: Candida parapsilosis
مشخصات کلنی: کلنیهای کاندیدا پاراپسیلوزیس در محیط سابورودکستروز آگار، سفید، کرمی، براق و صاف یا چین خورده است. در محیط آبگوشت سابورو روی سطح تشکیل کلنی نمیدهد.
مشخصات میکروسکپی: در محیط کورن میل آگار تووین ۸۰ و انکوباسیون در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد بمدت ۷۲ ساعت بلاستوسپورهائی تولید میکند که در طول هایفی کاذب قرار میگیرند. نوعاً سودوهایفی ممکن است به شکل خمیده درآمده و سلولهای هایفی بزرگ بنام “giant cells” مشاهده شوند.
نمای مرفولوژیک کاندیدا پاراپسیلوزیس در محیط آگارکورن میل توین ۸۰
۲ – کاندیدا تروپیکالیس: Candida tropicalis
مشخصات کلنی: در محیط سابورو دکستروز آگار کلنیهای کاندیدا تروپیکالیس کرمی رنگ با حاشیهی تا حدودی میسلیال هستند. در محیط آبگوشت سابورو یک فیلم نازک سطحی و نیز حباب تولید میکند.
مشخصات میکروسکپی: در محیط کورن میل توین ۸۰ آگار و در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد بعد از ۷۲ ساعت، بلاستوسپورهای بیضوی شکلی که در امتداد سودوهایفیهای طولانی واقع شدهاند تولید میکند. بلاستوسپورها ممکن است بصورت منفرد یا خوشهای ظاهر شوند. سودوهایفی نیز انشعابات فراوانی دارد. کاندیدا تروپیکالیس ممکن است هایفی حقیقی هم تولید نماید.
۳ – کاندیدا کروزئی: C. krusei
مشخصات کلنی: کلنیها در محیط سابورو دکستروز آگار در دمای ۲۵ درجه، سفید، مات و صاف با حاشیههائی صاف یا لوبوله است. این ایزوله در دمای ۴۲ درجه رشد میکند اما بر روی محیط کشت محتوی سیکلوهگزامید رشد نمیکند.
مشخصات میکروسکپی: بر روی محیط کورن میل آگار بعد از ۷۲ ساعت انکوباسیون در دمای ۲۵ درجه، سودوهایفی فراوانی با مقادیر متوسطی شاخه و انشعاب تشکیل میشود. هنگام شناسائی این گونه باید دقت شود زیرا ایزولههای کاندیدا اینکونسپیکوآ Candida inconspicua از نظر مورفولوژی و خواص بیوشیمیائی مشابه کاندیدا کروزئی است. این ایزوله در ارتباط با بیماریهای انسانی و مقاومت شناخته شدهاش نسبت به فلوکونازول اهمیت دارد.
کاندیدا کروزئی
۴ – کاندیدا کفیر: Candida kefyr
مشخصات کلنی: نام قبلی آن کاندیدا سودوتروپیکالیس بوده است. کلنیهای آن در محیط سابورو دکستروز آگار کرم رنگ، متمایل به زرد و صاف میباشد. در محیط آبگوشت سابورو روی سطح تشکیل کلنی نمیدهد.
کلنیهای کاندیدا کفیر بر روی محیط سابورو
منظره میکروسکپی: در محیط کورن میل توئین ۸۰ آگار، دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و بمدت ۷۲ ساعت بلاستوسپورهائی تولید میکند که طویل شده و به موازات یکدیگر دیده میشوند. بلاستوسپورها در امتداد سودوهایفی خمیده شده دیده میشوند.
نمای مرفولوژیک کاندیدا کفیر بر روی محیط آگار کورن میل توین ۸۰
۵ – کاندیدا لوزیتانیا: Candida lusitaniae
مشخصات کلنی: در محیط سابورو دکستروز آگار و در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد کلنیها سفید تا کرم رنگ، براق و صاف هستند اما ممکن است چین خورده نیز باشند. حاشیه کلنیها ممکن است با سودوهایفیها مشخص شود. این گونه در دمای ۴۲ درجه سانتیگراد و نیز بر روی محیط کشت حاوی سیکلوهگزامید رشد میکند.
مشخصات میکروسکپی: بر روی محیط کورن میل آگار بعد از ۷۲ ساعت انکوباسیون در ۲۵ درجه، سودوهایفیهای منشعب فراوانی ممکن است دیده شوند. برخی استرینها اساساً سودوهایفی تولید نمیکنند.
توضیح ویژه:
کاندیدا لوزیتانیا ارگانیسم شناخته شدهای از نظر مقاومت به آمفوتریسین B میباشد. اولین گزارش مربوط به عفونت کشنده در یک بیمار نوتروپنیک اتفاق افتاد که در آن ایزوله اولیه به آمفوتریسین B حساس بود ولی ایزولههای بعدی نسبت به آمفوتریسین B مقاومت پیدا کرده بودند.
کاندیدا لوزیتانیا
Candida morphology on cornmeal agar
a = albicans, t=tropicalis, k=krusei, l=lusitaniae, g=glabrata, p=parapsilosis; chl=chlamydospore
کاندیدیازیس بعلت گونههای غیر آلبیکنسی
تمام عفونتهای کاندیدائی مربوط به کاندیدا آلبیکنس نیست؛ بیشتر از یک سوم اینگونه عفونتها مربوط به دیگر گونهها از جمله کاندیدا گلابراتا، کاندیدا کروزئی، کاندیدا پاراپسیلوزیس، کاندیدا تروپیکالیس، کاندیدا سودوتروپیکالیس و گاهی اوقات گونههای بسیار مقاومی مانند کاندیدا لوزیتانیا است. در یک مطالعه [Diagn Microbiol Infect Dis 1999 sep,35(1):19-25] تنها ۵۳% از ۱۷۰ مورد کاندیدمی مربوط به کاندیدا آلبیکنس بوده است. گونههای شایع و مهم عبارتند از:
کاندیدا گلابراتا (C.glabrata):
مقاومت به فلوکونازول در کاندیدا گلابراتا (نام قبلی آن تورولوپسیس گلابراتا بوده است) شایع و رایج است؛ (از قرار معلوم این مقاومت با میانجیگری ژن CgCDR1 انجام میشود). مصرف بدون نسخه داروهای ضد قارچی از دسته آزولها مانند میکونازول و کلوتریمازول ممکن است سبب گسترش مقاومت به فلوکونازول گردد. داروی انتخابی در حال حاضر هنوز آمفوتریسین B است. به نظر میرسد که وریکونازول (voriconazole) بر علیه کاندیدا گلابراتا بسیار مؤثرتر از فلوکونازول باشد. یافتههای مربوط به ۱۳۹ بیمار مبتلا به فونژمی با کاندیدا گلابراتا در منابع زیر موجود است:
Medicine (Baltimore) 1999 Jul;78(4):220-7
Clin microbial Rev 1999 Jan;12(1):80-96
کاندیدا کروزئی (C.krusei):
کاندیدا کروزئی نیز ذاتاً نسبت به فلوکونازول مقاوم است. در اینجا نیز ممکن است وریکونازول مورد استفاده قرار گیرد. ۵۷ مورد فونژمی بعلت کاندیدا کروزئی در مقاله زیر بحث شده است:
Arch Intern Med 2000 Sep 25;160(17): 2659-64
سایر گونههای کاندیدا:
عفونت با کاندیدا پاراپسیلوزیس (C.parapsilosis) در بخشهای مراقبت ویژه نوزادان و در حالتهای ضعف و اختلال در سیستم ایمنی روز به روز اهمیت بیشتری پیدا میکند.
کاندیدا تروپیکالیس برخلاف کاندیدا آلبیکانس معمولاً بعنوان یک ارگانیسم کومنسال در نظر گرفته نمیشود؛ بدین معنی که جدا کردن آن نشان دهنده عفونت است و ممکن است ارگانیسم مقاوم به فلوکونازول باشد.
وضعیت در مورد کاندیدا لوزیتانیا جالب و البته نگران کننده است زیرا نسبت به آمفوتریسین B مقاوم است ولی بصورت شگفت انگیزی ممکن است به فلوکونازول پاسخ دهد.
منابع:
قارچ شناسی پزشکی جامع، تألیف دکتر فریده زینی، دکتر امیر سیدعلی مهبد، دکتر مسعود امامی. انتشارات دانشگاه تهران، ۱۳۸۳
دکتر محمد قهری – آزمایشگاه رسالت
ماهنامه اخبار آزمایشگاهی