معماری
روش تهيه رنگ متيلن بلوي بافره

روش تهيه رنگ متيلن بلوي بافره (گسترش مستقيم)

تهيه رنگ متيلن بلوي بافره (گسترش مستقيم)

Nair’s Buffered Methylene blue stain (Direct smear)

اين روش آماده سازي گسترش مستقيم جهت مشخص نمودن جزئيات هسته تروفوزوئيتها و افتراق آنها از ماكروفاژها بكار مي رود، بويژه زماني كه از محلول با PH پائين استفاده شود كه سبب نفوذ هرچه بيشتر رنگ به داخل ارگانيسم مي گردد.

بعد از 5 تا 10 دقيقه سيتوپلاسم به رنگ آبي كمرنگ و هسته به رنگ آبي بسيار پر رنگ ديده مي شود. گسترشها بايد در مدت 30 دقيقه مورد بررسي قرار گيرند.

 

روش كار

  • تهيه محلول ذخيرهA

55/11 ميلي ليتر از اسيد استيك Acetis Acid (CH3COOH) را با آب مقطر به حجم 1000 ميلي ليتر مي رسانيم.

  • تهيه محلول ذخيره B

4/16 گرم استات سديم بدون آب (NaC2H3O2) ويا 2/27 گرم استات سديم با 3 مولكول آب

(NaC2H3O2,3H2O) را درآب مقطر حل نموده وحجم نهايي را به 100 ميلي ليتر مي رسانيم.

طبق جدول زير محلول BوA را مخلوط نموده و با آب مقطر به حجم 100 ميلي ليتر مي رسانيم :

 

محلول ذخيره B      محلول ذخيره A

(ميلي ليتر) (ميلي ليتر) PH
7/3 3/46 6/3
6 44 8/3
9 41 4
2/13 8/36 2/4
5/19 5/30 4/4
5/24 5/25 6/4

 

06/0 گرم (60 ميلي گرم ) پودر متيلن بلو را به 100 ميلي ليتر از محلول بافر اضافه كرده و كاملاً حل مينمائيم. معمولاً استفاده از بافر استات 6/3 = PH بهترين نتيجه را ايجاد مي كند.

 

روش انجام آزمايش مستقيم

  • يك قطره سرم فيزيولوژي 85/0% رادر طرف چپ و يك قطره از محلول لوگل را در طرف راست لام قرار مي دهيم.
  • مقدار خيلي كمي از مدفوع (به اندازه 2 ميلي گرم و يا در حدي كه نوك يك اپليكاتور را به داخل نمونه فرو كنيم) را در سرم فيزيولوژي به حالت يكنواخت در مي آوريم.اگر بيشتر از اين مقدار برداشته شود،گسترش رقيق شده و احتمال مشاهده انگل كم مي شود.

عمل فوق را بوسيله اپليكاتور ديگري با محلول لوگل انجام مي دهيم.مي توان يك قطره از محلول متيلن بلوي بافره را نيز بر روي لام ديگري قرار داد و به طريقه فوق نمونه مدفوع را در آن به حالت يكنواخت در آورد.

جهت بررسي نمونه هاي فوق يك لامل(mm) 22*22 بر روي نمونه تهيه شده قرار مي دهيم .

ترجيحاً مي توان نمونه هاي تهيه شده در سرم فيزيولوژي و يد را بر روي لامهاي جداگانه اي قرار داد كه در اين صورت امكان جاري شدن مايع بر روي ميكروسكوپ كاهش مي يابد.

اگر نمونه آبكي يا موكوئيدي باشد، نمونه برداري بوسيله اپليكاتور مشكل است، لذا از دو اپليكاتور به كمك هم طوري استفاده كنيد كه حالت يك قاشقك را ايجاد نمايد.

جهت بررسي گسترش ابتدا با عدسي با بزرگنمائي كم (10*) تمام قسمتهاي گسترش (لامل) را بررسي مي كنيم. اگر مورد مشكوكي مشاهده گرديد از عدسي با بزرگنمائي (40*) براي بررسي جزئيات استفاده مي نمائيم . حتي در مواردي كه مورد مشكوكي مشاده نگرديد ، حداقل يك سوم سطح لامل بايد با عدسي با بزرگنمائي 40* مورد بررسي مجدد قرار گيرد.

معمولاً تك ياخته ها نور را منعكس مي كنند و چون اين گونه ارگانيسم ها كمرنگ مي باشند، مي توانند نور را از خود عبور دهند و مشاهده آنها مشكل گردد، بنابراين بايد با نور كم گسترشها را بررسي نمود.

زمانيكه نور زياد باشد بيشتر ارگانيسمها به خوبي مشاهده نمي شوند(تجربه نويسنده : بخصوص در زمانيكه نمونه محتوي اووسيست ايزوسپورابلي باشد).

بهتر است عمل كاهش نور را به جاي پائين آوردن كندانسور با بستن ديافراگرم انجام دهيد. ميزان نور بايد به نحوي تنظيم شود که عناصر سلولي موجود در مدفوع به خصوص کيست تک ياخته ها بتوانند نوررامنعكس كنند.

اگر اطراف لامل كاملاً با پارافين مذاب مسدود شده باشد، مي توان با استفاده از عدسي روغني (بزرگنمايي 100* ) آن را بررسي نمود. ترجيحاً در اين موارد استفاده از لامل ضخيم توصيه مي شود.

در صورت استفاده از محلول غليظ يد عناصر داخل مدفوع به يكديگر چسبيده و سبب كاهش انكساروعبور نور از         ارگانيسم و باعث اشكال در تشخيص مي گردد و چنانچه محلول رقيق يد مورد استفاده قرار گيرد، عناصر داخل ارگانيسم به خوبي رنگ نمي گيرند. استفاده از محلول لوگلي كه در رنگ آميزي باكتريها استفاده مي شود، به دليل غلظت آن جهت رنگ آميزي انگلها توصيه نمي گردد.

چنانچه در بررسي گسترش ، حركت تروفوزوئيت كم شده باشد، مي توان با قرار دادن يك سكه كوچك گرم شده دركنار گسترش ، حركت آن را تحريك نمود. همچنين با فشار روي لامل نيز مي توان باعت حركت مايع و تحريك تروفوزوئيت جهت حركت نمودن گرديد.

 

گزارش نتايج :

مثالهايي از گزارش نتيجه مثبت نمونه مدفوع، شامل موارد زير مي باشد:

  • Giardia lamblia trophozoites present .
  • Entamoeba coli cysts present .
  • Ascaris lumbricoides eggs present .
  • Strongyloides stercoralis larva present.
  • Lsospora belli oocysts present.

 

همه عناصر و سلولهاي موجود در نمونه مدفوع نيز بايد تشخيص داده شده و گزارش گردند مانند:

Moderate charcot – leyden crystals present.

Few red blood cells (RBCS) present.

     

 

 

 

 

References:

 

  • procedures for the recovery and identification of parasites from the intestinal tract , Approved Guideline (2006).CLSI=NCCLS.(M28-A)
  • Topley & Wilson,s .(1998) .Microbiology and Microbial infections. Ninth edition . Volume 5 (parasitology)

Pub: Arnold

  • Ellenjo Baron and Sydney M.finegold(1996) .Bailey & scott,s . Diagnostic Microbiology.
  • Basic Laboratory Methods in Medical parasitology (1991) pub : world Health Organization (WHO)
  • John Bernard Henry, M.D.(1996) . Clinical diagnosis and management by laboratory Methods . Nineteenth edition.
  • Connie R.Mahon .etal.(1995) .Textbook of diagnostic Microbiology . pub .saunders
  • Elmer W. koneman, etal .(1997) .Color Atlas and Diagnostic Microbiology .fifth edition. Pub. Williams & wilkin,