معماری
Novy-Mac Neal-Nicolle

روش تهیه محیط کشت دوفازی NNN

روش تهیه محیط کشت دوفازی Novy-Mac Neal-Nicolle — NNN
محیط آگار غذایی :
باکتو آگار                         14 گرم
(NaCl ) نمک طعام       6 گرم
آب مقطر                     900 میلی لیتر
—————————-
این محیط جهت تشخیص انگل لیشمانیا استفاده می شود.آب را تا دمای جوش حرارت داده و نمک و آگار به مقدار ذکر شده به آن اضافه کنید.  آنقدرمحلول را بجوشانید تا دانه های آگار حل شود، سپس این محلول را داخل لوله آزمایش درپیچ دار بریزید (حدود یک سوم حجم لوله )، درب آن را بسته وبا اتوکلاو( دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه)  استریل نمائید. این لوله ها را میتوان تا زمان استفاده در یخچال نگهداری کرد.
هنگام استفاده، لوله را درآب جوش قرار داده تا محیط مایع شود، سپس تا حرارت 40 تا 50 درجه خنک کنید. به هر لوله حدود یک سوم حجم محیط15% خون دفیبرینه خرگوش اضافه کنید، درب لوله را ببندید و بین دو کف دست بخوبی بچرخانید تا کاملا محتویات آن  مخلوط شود، پس ازآن در درجه حرارت اطاق بصورت مایل (Slant) قرار دهید تا سفت شود، وآنگاه  به یخچال (4 تا 8 درجه) منتقل نمائید، جهت اطمینان از آلوده نبودن؛ یکی از لوله ها را در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد  به مدت 24 ساعت قرار دهید.محیط تهیه شده تا 4 هفته قابل استفاده می باشد و آماده انتقال نمونه است. بدین ترتیب فاز جامد محیط NNN تهیه می شود.
فاز مایع  معمولا شامل سرم فیزیولوژی نرمال یا RPMI استریل می باشد که به فاز جامد اضافه می شودو برای ممانعت از رشد باکتریها از پنی سیلین و استرپتومایسین با غلظتهای IU/ml 100و g/ml100 اضافه می شوند. فاز مایع در هنگام کار به فاز جامد اضافه می شود و سطح شیبدار را می پوشاند.
نمونه های بیوپسی ضایعات، خون محیطی، مغزاستخوان، یا نمونه تهیه شده ازحاشیه ضایعات و حتی مواد آسپیره شده ازبستر ندول را می توان دراین محیط کشت داد. نمونه ها به عمق 2 میلیمتری از انتهای  سطح شیب دار وارد آگار مغذی می شوند، پس ازانتقال نمونه، محیط  کشت را دردمای  18  تا 25 درجه سانتیگراد ( انکوباتور)  نگهداری کنید. انگل ها درمایع جمع شده در قسمت شیب دارمحیط، رشد می کنند.
لوله ها 2-3  روز درمیان تا یک ماه مورد بررسی قرار می گیرند ( در ارتباط با گونه انگل و شرایط کشت متفاوت می باشد)  و درصورت عدم مشاهده انگل با میکروسکوپ فازکنتراست، کشت منفی درنظر گرفته می شود. اما اگر تعداد انگل کم  باشد زمان بیشتری را برای رشد نیاز دارد. در صورت وجود آلودگی با باکتری ها و قارچها،  انگل توانائی رشد در محیط را ندارد.

پاسخ دهید