معماری
تغلیط مدفوع برای انگل

روشهای تغلیظ مدفوع برای تشخیص انگلها

ﻫﺪف اصلی از انجام آزﻣﺎﯾﺶ مستقیم نمونه ﻣﺪﻓﻮعی ﻛﻪﺣﺎوی ﻣﺎده  ﻧﮕﻬﺪارﻧﺪه نمیباشد،  ﺑﺮرﺳﻲﺣﺮﻛﺖﺗﺮوﻓﻮزوﺋﯿﺖ ﺗﻚﯾﺎﺧﺘﻪﻫﺎ،  ﮔﺰارش  رﻧﮓ، ﻗﻮام،  ﻣﯿﺰانWBC،RBC  و غیره اﺳﺖ.

ﺑﻨﺎﺑﺮاﯾﻦ روش ﺻﺤﯿﺢ اﯾﻦ اﺳﺖ ﻛﻪ ﮔﺰارش آزﻣﺎﯾﺶ ﻣﺴﺘﻘﯿﻢ نموﻧﻪ ﺑﻪﺻﻮرت  ﮔﺰارش  اوﻟﯿﻪ  ﺑﻪ  ﭘﺰﺷﻚ  داده  ﺷﻮد  و  ﮔﺰارش  روش  ﺗﻐﻠﯿﻆ  و رﻧﮓ آﻣﯿﺰی دائمی ﺑﻌﺪا ﺑﻪ اﻃﻼع ﭘﺰشک‌ برسد…

میتوان در رابطه ﺑﺎ ﻧﻮع ﻣﺎده ﻧﮕﻬﺪارﻧﺪهﺑﺮ روی نمونه،آزﻣﺎﯾﺶ ﺗﻐﻠﯿﻆ و رﻧﮓ آﻣﯿﺰی دائمی را انجام داد. اﺳﺘﻔﺎده از روش ﺗﻐﻠﯿﻆ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان قسمتی از روش ﻛﺎﻣﻞ بررسی نمونه ﻣﺪﻓﻮع ﺟﻬﺖ ﺟﺴﺘﺠﻮی اﻧﻮاع اﻧﮕﻞﻫﺎ ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ. ﺗﻌﺪاد ﻛﻢ ارﮔﺎﻧﯿﺴﻤﻬﺎ ﻛﻪ ممکن اﺳﺖ در آزﻣﺎﯾﺶ ﻣﺴﺘﻘﯿﻢ ﺗﺸﺨﯿﺺ داده ﻧﺸﻮد، ﺑﻪوﺳﯿﻠﻪ اﯾﻦ روش ﺷﻨﺎﺳﺎیی ﻣﻲﮔﺮدد. دو ﻧﻮع روش ﺗﻐﻠﯿﻆ وﺟﻮد دارد.

ﺷﻨﺎور ﺳﺎزی (Flotation)

رﺳﻮب گیری (Sedimentation)

اﺳﺎس اﯾﻦ روﺷﻬﺎ آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﻛﯿﺴﺘﻬﺎی ﺗﻚ ﯾﺎﺧﺘﻪ ﻫﺎ، اووﺳﯿﺴﺖ،
تخم ﻛﺮﻣﻬﺎ و ﻻروﻫﺎ از ﻣﻮاد اضافی ﻣﻮﺟﻮد در ﻣﺪﻓﻮع ﺑﻮﺳﯿﻠﻪ ﻋﻤﻞ ﺳﺎنتریفوژ نمودن و ﯾﺎ ﺑﺮ اﺳﺎس ﺗﻔﺎوت در وزن مخصوص ﺟﺪا میﮔﺮدد.

روش اﺳﺘﺎﻧﺪارد ﺷﻨﺎورﺳﺎزی ﺑﺎ ﺳﻮﻟﻔﺎت روی

در روش ﺷﻨﺎورﺳﺎزی، ﻛﯿﺴﺘﻬﺎی ﺗﻚ ﯾﺎﺧﺘﻪ و ﺑﻌﻀﻲ از تخم ﻛﺮﻣﻬﺎ از ﻣﻮاد اﺿﺎﰲ ﻣﻮﺟﻮد در ﻣﺪﻓﻮع، ﺑﺮ اﺳﺎس اﺳﺘﻔﺎده از ﯾﻚ ﻣﺎﯾﻊ ﺑﺎ وزن مخصوص ﺑﺎﻻ، ﺟﺪا ﻣﻲ ﮔﺮدﻧﺪ. ﻋﻨﺎﺻﺮ انگلی در ﺳﻄﺢ ﻣﺎﯾﻊ ﻣﺸﺎﻫﺪه و ﻣﻮاد اضافی در ﺗﻪ ﻟﻮﻟﻪ ﺑﺎقی میماند. اﯾﻦ روش آﺳﺎن ﺗﺮ از روش رﺳﻮب گیری اﺳﺖ، اﻣﺎ ﺑﻪ ﻫﺮ ﺣﺎل ﺑﯿﺸﱰ تخم ﻛﺮﻣﻬﺎ ﻣﺎﻧﻨﺪ تخم های درﯾﭽﻪدار و ﯾﺎ تخمهای ﺧﯿﻠﻲ ﺳﻨﮕﲔ ﻣﺎﻧﻨﺪ تخم آﺳﻜﺎرﯾﺲ غیرﺑﺎرور ﺑﺎ اﯾﻦ روش ﺗﻐﻠﯿﻆ نمیگردند.

ﺑﺎﯾﺪ وزن مخصوص محلول ﺳﻮﻟﻔﺎت روی در ﺣﺪ معینی ﺑﺎﺷﺪ و ﻧﯿﺰ همه ارﮔﺎﻧﯿﺴﻢ ﻫﺎیی ﻛﻪ در ﺳﻄﺢ ﻣﺎﯾﻊ و در رﺳﻮب تجمع ﺣﺎﺻﻞ ﻛﺮده اﻧﺪ ، ﺟﺪا ﮔﺮدﯾﺪه و ﺗﺸﺨﯿﺺ داده ﺷﻮﻧﺪ. ﺑﺎﯾﺪ نمونه در ﻣﺪت ١۵ ﺗﺎ ٢٠دﻗﯿﻘﻪ ﺑﻌﺪ از ﻣﺮﺣﻠﻪ سانتریفوژ ﺑﺮرسی ﺷﻮد ، در ﻏﲑ اﯾﻦ ﺻﻮرت ارﮔﺎﻧﯿﺴﻢ ﺷﻜﻞ ﻃﺒﯿﻌﻰ ﺧﻮد را از دﺳﺖ داده و ﯾﺎ تخریبﻣﻰ ﮔﺮدد.

نمونه :
ﺑﺎﯾﺪ ﺗﺎزه ﺑﺎﺷﺪ و ﯾﺎ در محلول ﻧﮕﻬﺪارﻧﺪه ﻣﺎﻧﻨﺪ ﻓﺮﻣﺎﻟﲔ ۵ ﯾﺎ ١٠درﺻﺪ ﺑﺎﻓﺮه و ﯾﺎ در محلول سدیم استات استیک اسید فرمالین نگهداری شود( محلولSAF)

ﺑﺮای ﳕونه ﻫﺎی ﺧﯿﻠﻲ آبکی ﻣﺮﺣﻠﻪ ﺳﺎنتریفوژ روش ﺗﻐﻠﯿﻆ را میتوان ﺣﺬف نمود.

ﻣﻮاد لازم:

فرمالین  ۵  ﯾﺎ  ١٠  درﺻﺪ  ﺑﺎﻓﺮه  ﯾﺎ SAF
ﺳﺮم  ﻓﯿﺰﯾﻮﻟﻮژی  ٨۵/٠ﮔﺮم درﺻﺪ
محلول ﺳﻮﻟﻔﺎت روی ( محلول آبی ٣٣%)

ﺣﺪود ٣٣٠ ﮔﺮم ﺳﻮﻟﻔﺎت روی را ﺑﺎ آب ﻣﻘﻄﺮ ( ﺑﻪ ﻣﯿﺰان ۶٧٠ میلی لیتر ) ﺑﻪ ﺣﺠﻢ یک لیتر ﺑﺮﺳﺎﻧﯿﺪ.

وزن مخصوص محلول ﻓﻮق ﺑﺎﯾﺪ ﺟﻬﺖ نمونه ﻫﺎی ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪه در فرمالین ﺑﻪ ﻣﯿﺰان ٢٠/١ و ﺑﺮای نمونه ﻫﺎی ﺗﺎزه ١٨/١ ﺑﺎﺷﺪ. در غیر اﯾﻦ ﺻﻮرت ﺑﺎﯾﺪ ﺑﻮﺳﯿﻠﻪ اﺿﺎﻓﻪ نمودن ﺳﻮﻟﻔﺎت روی و ﯾﺎ آب ﻣﻘﻄﺮ ﺗﻨﻈﯿﻢ ﮔﺮدد و در ﺑﻄﺮﯾﻬﺎی درﭘﯿﭻ دار ذخیره ﮔﺮدد. ﺗﺎرﯾﺦ اﻧﻘﻀﺎء را بمدت ٣۶ﻣﺎه ﺑﻌﺪ از ﺗﺎرﯾﺦ ﺳﺎﺧﺖ ﺑﺮ روی ﺑﺮﭼﺴﺐ ﺷﯿﺸﻪ ﺑﻨﻮﯾﺴﯿﺪ.

 

روش ﻛﺎر:

مرحله اول

ﺣﺪود۴ﮔﺮم ﻣﺪﻓﻮع ﺗﺎزه را داﺧﻞ١٠ سی‌ سی‌ ﻓﺮمالین ١٠%  (درون ﯾﻚ ﻇﺮف ﻣﻨﺎﺳﺐ از ﻧﻈﺮ ﺣﺠﻢ  نهایی ) بریزید.
ﻣﺪﻓﻮع و ﻓﺮﻣﺎلین راﻛﺎﻣﻼ مخلوط ﻛﻨﯿﺪ.
مخلوط ر ا ﺑﻪ ﻣﺪت ﺣﺪاﻗﻞ ٣٠دﻗﯿﻘﻪ ﺟﻬﺖ ﺛﺎﺑﺖ ﺷﺪن ﻧﮕﻪ دارﯾﺪ.

اﮔﺮ نمونه در محلول ﻧﮕﻬﺪارﻧﺪه ﻓﺮﻣﺎلین و ﯾﺎ SAF ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪه اﺳﺖ ، مخلوط ﻣﺎده ﻧﮕﻬﺪارﻧﺪه و ﻣﺪﻓﻮع را ﺑﻪ ﺧﻮﰉ مخلوط ﻛﻨﯿﺪ.

مرحله دوم

ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ اﻧﺪازه و ﻗﻮام نمونه ، ﺗﻌﺪاد ﻛﺎفی ﮔﺎز ﻣﺮﻃﻮب را روی  ﻫﻢ  ﻗﺮار  داده  و  آن  را  داﺧﻞ  ﯾﻚ  ﻗﯿﻒ  ﺑﮕﺬارﯾﺪ.
ﻗﯿﻒ  را داﺧﻞ یک ﻟﻮﻟﻪ  ﺗﻪ  مخروطی  ﮔﺬاﺷﺘﻪ  و  ﺣﺪود ٨  سی سی  از  مخلوط ﻓﻮق را ﺻﺎف نمایید ﺗﺎ رﺳﻮﺑﻲ ﺑﻪ اﻧﺪازه نیم  ﺗﺎ یک سی سی ایجاد ﻛﻨﺪ.
اﮔر نمونه  در ﻣﺎده ﻧﮕﻬﺪارﻧﺪه ﻓﺮمالین و ﯾﺎ SAF ﻗﺮار داده ﺷﺪه ﺑﺎﺷﺪ ، ﺣﺪود ۴ – ٣ سی سی کافی اﺳﺖ ﻣﮕﺮ اﯾﻨﻜﻪ نمونه ﻣﺪﻓﻮع در اﺑﺘﺪا ﻛﻢ ﺑﺎﺷﺪ.
محلول ﺳﺮم ﻓﯿﺰﯾﻮﻟﻮژی ۸۵/. درصد را ﺗﺎ ﺳﺮ ﻟﻮﻟﻪ اﺿﺎﻓﻪ ﻛﻨﯿﺪ و بمدت ١٠ دﻗﯿﻘﻪ با دور ۵۰۰ سانتریفوژ نمایید.
ﻣﻘﺪار رﺳﻮب ﺑﺪﺳﺖ آﻣﺪه ﺑﺎﯾﺪ ﺣﺪود نیم ﺗﺎ یک سی سی  ﺑﺎﺷﺪ.

رﺳﻮب ﺧﯿﻠﻲ ﻏﻠﯿﻆ و ﯾﺎ خیلی رﻗﯿﻖ ﻧﺸﺎﻧﺪﻫﻨﺪه روش ﻧﺎدرﺳﺖ ﺗﻐﻠﯿﻆ اﺳﺖ .

ﻣﺎﯾﻊ رویی را دور ریخته و رﺳﻮب را در ا ﺗﺎ ٢ سی سی ﺳﻮﻟﻔﺎت روی ﺑﻪ ﺣﺎﻟﺖ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن درآورﯾﺪ و ﺳﭙﺲ ﺗﺎ ٣- ٢ سی سی  ﻟﺒﻪ ﻟﻮﻟﻪ را ﺑﺎ محلول ﺳﻮﻟﻔﺎت روی ﭘﺮ ﻛﻨﯿﺪ.
بمدت ﯾﻚ دﻗﯿﻘﻪ با دور ۵۰۰ سانتریفوژ ﻛﻨﯿﺪ .

بعد از سانتریفوژ کردن،دولایه تشکیل میشود:
مقدار کمی رسوب در ته لوله و یک لایه سولفات در بالای لوله مشاهده خواهد شد…

کیست تک یاخته ها و بعضی از تخم کرمها در سطح و بعضی از تخمهای سنگین و یا دریچه دار در رسوب قرار میگیرند.

تغلیظ مدفوع به روش شناور سازی

ادامه ی کار
مرحله سوم
بدون اینکه لوله را از سانتریفوژ خارج کنید، یک یا دو قطره از سطح مایع را با کمک یک پی­پت پاستور و یا یک لوپ سیمی حرارت داده و سرد شده بردارید و روی یک لام بگذارید.

هرگز لوپ را به طور عمقی وارد مایع نکنیدو بلکه فقط با سطح آن را به طریقی تماس دهید که لوپ موازی با سطح مایع قرار گیرد (نه اینکه با آن سطح با آن زاویه °۹۰ بسازد). مطمئن باشید که نوک پی­پت یا لوپ زیر سطح مایع وارد نشود.

یک لامل ۲۲×۲۲ و یا ۲۴×۲۲ میلی متر روی آن قرار دهید. جهت آماده سازی نمونه از محلول لوگل می­توان استفاده نمود.

با عدسی با بزرگ نمایی (۱۰×) تمام سطح لامل را بررسی کنید.
اگر مورد مشکوکی مشاهده گردید، با بزرگ نمایی (۴۰×) برای مطالعه جزئیات بیشتر استفاده نمائید.
باید حداقل ۳/۱ سطح لامل را بررسی کنید، حتی اگر مورد مشکوکی مشاهده نگردید.

قبل از آزمایش و یا بعد از آن می­توان لام مرطوب را جهت آموزش به دیگران در یک پلیت محتوی کاغذ مرطوب در روی یک اپلیکاتور و یا پایه مخصوص لام قرار دهید. هوای محفظه باید کاملاً مرطوب باشد اما خیس نباشد.

 

نکات قابل توجه در روش تغلیظ مدفوع به روش شناور سازی

استفاده از آب لوله کشی می­تواند جایگزین استفاده از سرم فیزیولوژی گردد.
بعضی از کارکنان ترجیح می­دهند که در تمام مراحل روش به جای آب، محلول فرمالین ۵%  یا ۱۰% استفاده کنند.

اگر نمونه ­ها در SAF نگهداری شده اند، آزمایش از مرحله ۲ شروع می­شود.

اگر در مورد نمونه ­های تازه از آب لوله کشی استفاده شود، ممکن است انگل بلاستوسیستیس هومینیس از بین برود.

اگر ترجیح می­دهید که جهت نمونه برداری لوله ­ها را از سانتریفوژ خارج نمائید، دقت کنید که قبل از نمونه برداری مایع تکان نخورد.

بعضی از کارکنان ترجیج می­دهند که مقدار کمی سولفات روی را به سطح لوله اضافه کرده، به نحوی که سطح مایع یک برآمدگی کوچک محدب شکل را تشکیل دهد و سپس یک لامل بر روی سطح آن قرار دهند. باید ۵ دقیقه صبر نموده و در این مدت لوله را تکان ندهید، سپس لامل را با دقت از روی لوله برداشته و جهت بررسی روی یک لام قرار دهید.

محدودیت­های روش

تک یاخته ­های مشاهده شده در نمونه باید بوسیله روش رنگ آمیزی دائمی تائید شوند. بعضی از تک یاخته ­ها کوچک بوده و تشخیص آنها با این روش مشکل می­باشد.

باید حداکثر در فاصله زمانی ۵ دقیقه بعد از توقف کامل سانتریفوژ، سطح مایع جهت بررسی، برداشت گردد چون هر چه تماس ارگانیسم­ها با محلول سولفات روی بیشتر شود، امکان اینکه شکل طبیعی خود را از دست دهند، بیشتر می­باشد، به طوری که اگر کیست پروتوزوئرها و تخم کرم­های دارای دیواره ضخیم بیشتر از چند دقیقه در تماس با محلول سولفات روی با وزن مخصوص بالا قرار بگیرد، ممکن است متلاشی شده و یا شکل طبیعی خود را از دست بدهد.

اگر از روش شناور سازی، به عنوان تنها روش تشخیصی استفاده می­کنید، باید سطح مایع و هم رسوب آن را بررسی کنید تا مطمئن شوید که همه ارگانیسم­ها را جدا نموده و تشخیص می­دهید. به هر حال روش تغلیظ فرمالین- اتیل استات (اتر) بهترین روش جهت جداسازی و تشخیص تخم کرم­ها، کیست، تک یاخته ­ها و …. می­باشد.

 

روش استاندارد رسوب سازی

روش استاندارد فرمالین – اتیل استات (اتر)

جهت جدا سازی همه انواع تک یاخته ­ها، اووسیست­ها، تخم کرم­ها لاروها مناسب می­باشد. در این روش ارگانیسم­های سنگین­تر در مقایسه با عناصر سبک­تر محلول زوردتر ته نشین می­شود و علاوه بر مراحل سانتریفوژ، مراحل صاف کردن از بین بردن چربی را شامل می­گردد. در مرحله صاف کردن قطعات بزرگ و مواد اضافی مدفوع به وسیله صاف کردن از طریق چند لایه گاز مرطوب گرفته می­شوند.

ترکیبات از بین برنده شامل اتر، اتیل استات، Hemo  – De  و یا ترکیبات گزیلن (Xylene) می­باشد که چربی­های مدفوع را حل کرده و مواد اضافی را شناور می­سازد، اما به تخم کرم­ها، لاروها و یا کیست پروتوزوئرها آسیبی نمی­رساند. معمولاً در این روش تروفوزوئیت تک یاخته­ ها خراب شده و یا از بین می­رود.

مناسب­ترین روش تغلیظ استفاده از اتیل استات و ترکیبات دیگر مانند Hemo – De به جای اتر است که علت آن حفظ سلامتی افراد می­باشد. این ترکیبات دقیقاً همان عمل اتر را انجام می­دهند.

روش­های تغلیظ را می­توان روی نمونه­ های نگهداری شده درPolyvinyl Alcohol = PVA انجام داد، اما ممکن است در مرحله از بین بردن چربی، بعضی از ارگانیسم­ها به خصوص پروتوزوئرها خراب شوند. بنابراین  بهتر است که عمل تغلیظ را روی نمونه ­های نگهداری شده در فرمالین و عمل رنگ آمیزی را روی نمونه ­های نگهداری شده در PVA انجام داد.

برای نمونه ­های آبکی باید استفاده از یک مرحله سانتریفوژ (۱۰ دقیقه در دور ۵۰۰g) جایگزین روش تغلیظ معمولی گردد…

مواد و معرف­های لازم:

مواد از بین برنده چربی مانند اتیل استات و ……

فرمالین ۵ یا ۱۰ درصد بافر شده و یا Sodium Acetate – Acetic Acid – Formalin = SAF
سدیم کلرید۸۵%
محلول لوگل

 

روش کار:

حدود ۴ گرم از مدفوع تازه را داخل ۱۰ میلی لیتر فرمالین ۱۰% (در یک ظرف مناسب از نظر حجم نهایی) مخلوط کرده و اجازه دهید که جهت ثابت شدن عناصر انگلی موجود در مخلوط، به مدت ۳۰ دقیقه بماند اگر نمونه در محلول نگدارنده مانند فرمالین ۵ یا ۱۰ درصد و یا SAF گردیده است، آن را کاملاً مخلوط کنید.

در رابطه با مقدار و قوام مدفوع، تعداد کافی گاز مرطوب را روی هم قرار داده و سپس آن را داخل قیف بگذارید. قیف را داخل یک لوله ته مخروطی ۱۰ میلی لیتری و یا لوله ­های مخصوص سانتریفوژ قرار دهید. شکل ته لوله باید به نحوی باشد که مقدار کافی رسوب (۰٫۵ml – ۱ml) ایجاد کند. معمولاً ۸ میلی لیتر فرمالین و مدفوع آماده شده صاف می­گردد.

اگر نمونه در ماده نگهدارنده فرمالین یاSAF نگهداری شده است، حدود ۳ میلی لیتر از آن کافی است مگر اینکه نمونه حاوی مقدار خیلی کمی مدفوع باشد.

محلول سرم فیزیولوژی را تا نوک لوله اضافه کنید و به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۵۰۰ سانتریفوژ نمائید.
روی محلول را خالی کنید، رسوب به دست امده باید حدود۰٫۵ml تا ۱mlباشد.
دوباره رسوب را در سرم فیزیولوژی به حالت سوسپانسیون درآورده و تا نوک لوله را پر نمائید و مجدداً به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۵۰۰g سانتریفوژ نمائید.

 

در صورتی که بعد از مرحله اول شستشو، تفاوت رنگ کمی بین رسوب و مایع رویی مشاهده کردید می­توان مرحله دوم شستشو را حذف نمود و اگر محلول رویی تیره بوده و با کدورت زیادی داشت مایع رویی را خالی نموده و دوباره عمل سانتریفوژ را با محلول سرم فیزیولوژی تکرار کنید.

مایع روئی را خالی نموده و ان قدر فرمالین ۱۰% به رسوب ته لوله اضافه نمائید که ۳/۲ لوله را پر نماید سپس اجازه دهید که قبل از اضافه کردن مواد از بین برنده چربی، به مدت حداقل ۱۰ دقیقه بماند.

اگر مقدار رسوب ته لوله خیلی کم و یا نمونه اصلی مقدار زیادی موکوس باشد، مواد از بین برنده چربی را  اضافه نکنید(پاراگراف بعدی) و در عوض آن مقداری فرمالین اضافه و آن را سانتریفوژ نموده و سپس مایع رویی را خالی کرده و رسوب باقی مانده را بررسی نمائید.

۴ تا ۵ میلی لیتر اتیل استات و یا دیگر مواد از بین برنده چربی را اضافه کنید. در لوله را با چوب پنبه ببندید و ان را حداقل به مدت ۳۰ ثانیه به شدت تکان دهید. لوله را طوری نگه دارید که چوب پنبه دور از صورت شما و یا همکارتان باشد.

۱۵ تا ۳۰ ثانیه صبر کنید و سپس با دقت چوب پنبه را بردارید.

آن را به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۵۰۰g سانتریفوژ کنید. بعد از سانتریفوژ ۴ لایه تشکیل می­شود. اولین لایه کمی رسوب (حاوی انگل) است که در ته لوله تشکیل می­شود.لایه بعد فرمالین می­باشد و سپس آشغال­های مدفوع روی لایه فرمالین قرار گرفته و بقیه مواد از بین برنده چربی در نوک لوله قرار می­گیرد.

به وسیله اپلیکاتور تمام آشغال­های مدفوع را خارج کرده و سپس  همه محلول روئی را خالی نمائید و در حالی که لوله را سرازیر نگه داشته­ اید، به وسیله اپلیکاتوری که در سر آن پنبه پیچیده شده است و یا به وسیله سواب همه آشغال­های چسبیده به دیوار را خارج نمائید. سپس لوله را به حالت اولیه برگردانید.

وقتی که از لوله ­های شیشه­ ای استفاده می­کنید مایع خیلی راحت­تر به ته لوله بر می­گردد. اگر نمونه حاوی مقدار زیادی موکوس باشد مقدار سدیمان به حداقل می­رسد در این حالت جهت خارج نمودن مایع رویی لوله را وارونه نکنید. زیرا ممکن است همراه ان عمل رسوب را از دست بدهید. در این صورت مایع رویی را به وسیله پی­پت پاستور و …. خارج نمائید.

هنگامی که رسوب به ته لوله چسبیده و سفت است یک یا دو قطره سرم فیزیولوژی و یا فرمالین به آن اضافه نمائید. سپس مقدار کمی از آن را روی لام گذاشته و یک لامل با اندازه ۲۲×۲۲ روی آن قرار دهید. ممکن است از لامل با اندازه ۴۰×۲۲ هم استفاده نمود. اما معمولاً بیشتر از لامل ۲۲×۲۲ استفاده می­شود.

معمولاً ابتدا با بزرگ نمایی (۱۰×) تمام محدوده لامل را بررسی نمائید.

اگر مورد مشکوکی مشاهده گردید از عدسی با بزرگ نمایی (۴۰×) برای بررسی بیشتر جزئیات استفاده کنید. حداقل ۳/۱ محدوده لامل را باید با عدسی با بزرگنمایی (۴۰×) بررسی کنید، حتی اگر مورد مشکوکی مشاهده نگردید.

اگرچه بعضی از افراد اطراف را به وسیله پارافین و ….. مسدود کرده با عدسی با بزرگ نمایی (۱۰۰×) آن را بررسی می­کنند. اما معمولاض این کار انجام نمی­شود و تشخیص صحیح تک یاخته­ها به وسیله تهیه لام رنک آمیزی انجام می­پذیرد.

می­توان لام تهیه شده را جهت بررسی بیشتر و یا آموزش به افراد در یک پلیت محتوی کاغذ یا پنبه مرطوب روی یک اپلیکاتور یا وسیله نگهدارنده لام قرار داد. فضای محفظه باید کاملاً مرطوب بوده، اما خیس نباشد.

ممکن است کیست تک یاخته ­ها، اووسیست، تخم کرم­ها و لاروها در آماده سازی با روش تغلیظ با تعداد بیشتری در مقایسه با روش مستقیم مشاهده گردند.

 

روش رسوب سازی محدودیت­های این روش:

تک یاخته ­های مشاهده شده در آزمایش مستقیم نمونه باید به وسیله روش رنگ آمیزی دائمی تایید شوند. بعضی از تک یاخته ­ها کوچک بوده و تشخیص آنها در آزمایش مستقیم نمونه مشکل می­باشدو حتی اگر نوع انگل در آزمایش مستقیم تشخیص داده شود، جداسازی آن انگل با روش رنگ آمیزی دائمی، تشخیص را تایید می­کند.

مخصوصاً تایید تشخیص در مواردی که انگل انتاموباهیستولیتیکا جدا می­گردد. بسیار مهم است که این امر در مورد انگل انتاموباکلی صدق نمی­کند.

بعضی از ارگانیسم­ها مانند ژیاردیا لامبلیا، تخم­های کرم قلاب دار و بعضی مواقع تخم­های کرم تریکوسفال ممکن است در روش تغلیظ انجام شده با مدفوعی که در PVA نگهداری شده به خوبی مدفوعی که در فرمالین نگهداری شده، حفظ نگردند، به هر حال در مواردی که آلودگی به انگل­های فوق به میزان متوسط تا شدید باشد، این مشکل مشاهده می­گردد.

هم چنین شکل لاروهای استرونژیلوئیدس استرکورالیس و کیست­های انتاموباکلی در نمونه تغلیظ شده مدفوعی که در OVA نگهداری شده به خوبی نمونه­ های نگهداری شده در فرمالین مشخص نمی­باشند.

به طور معمول اووسیست ایزوسپورا بلی (Isospora belli) در رسوب نمونه تغلیظ شده مدفوعی که درPVA نگهداری نگردیده تخریب می­گردد