معماری

کنترل کیفی در آنالیز اسپرم

برای بدست آوردن نتایج قابل اطمینان در آزمایشگاه آندرولوژی لازم است تا از روش‌های کنترل کیفی مناسب استفاده نماییم. تفاوت نتایج بدست آمده از آنالیز اسپرم یک نمونه در بین آزمایشگاه‌های مختلف، نشانگر اهمیت استفاده از برنامه‌های کنترل کیفی و استاندارد نمودن روش‌ها است.

در هر آزمایشگاه باید یک برنامه تضمین کیفیت (QA) بر اساس روش‌ها و دستورالعمل‌های استاندارد وجود داشته باشد تا اطمینان حاصل شود نتایج بدست آمده از صحت و دقت کافی برخوردارند. پارامترهای اساسی آنالیز اسپرم از جمله غلطت، مورفولوژی و تحرک اسپرم باید تحت برنامه‌های کنترل کیفی داخلی و خارجی قرار داشته باشند. منظور از کنترل کیفی خارجی، انجام آزمایش بر روی یک نمونه توسط آزمایشگاه‌های مختلف و مقایسه نتایج آنها است.

ماهیت خطا در آزمایش‌هاي آنالیز اسپرم: برای اجرای برنامه‌های کنترل کیفی باید منابع خطا را شناخت.

هرگاه نتایج حاصل از چند بار اندازه‌گیری یک پارامتر به هم نزدیک باشد، دقت اندازه‌گیری بالاست و اگر نتایج حاصل به مقدار واقعی نزدیک باشند صحت اندازه‌گیری بالا خواهد بود.

در هر اندازه‌گیری دو نوع خطا ممکن است رخ دهد: راندوم و سیستمیک.

خطای راندوم بر دقت اندازه‌گیری اثر می‌گذارد و معمولاً ناشی از بروز خطای اتفاقی در برداشتن نمونه و یا خواندن نتایج مي‌باشد. با تکرار آزمایش توسط همان فرد و همان تجهیزات معمولاً خطای راندوم خود را نشان می‌دهد؛ بدین ترتیب که در اثر تکرار آزمایش نتایج متفاوتی به دست می‌آید.

خطای سیستمیک (که گاهی به آنBias گفته می‌شود) ناشی از فاکتورهایی است که همیشه در یک جهت بر نتایج اثر می‌گذارد (افزایش یا کاهش) و با تکرار اندازه‌گیری نیز تصحیح نمی‌شوند.

مهم‌ترین خطا در آنالیز اسپرم، خطای ناشی از برداشتن نمونه (sampling) است که یک خطای راندوم می‌باشد. هر چه نمونه بهتر مخلوط شود میزان این خطا کمتر خواهد بود، اما حتی زمانی که نمونه را بخوبی مخلوط می‌کنیم نیز میزان این خطا به صفر نخواهد رسید چون در هر حال انتشار اسپرماتوزوئیدها در مایع منی یکسان نیست و اگر چند بار از یک نمونه جهت آزمایش استفاده کنیم تفاوت‌هایی در غلظت، حجم و مورفولوژی اسپرم‌ها دیده می‌شود. هدف از برنامه کنترل کیفی در آنالیز اسپرم، کاستن از میزان خطاهای راندوم و سیستمیک تا حد ممکن است.

برنامه تضمین کیفیت (QA): در این برنامه پایش منظم و مداومی بر تمام مراحل اجرای آزمایش لحاظ می‌گردد. در برنامه QA، دستورالعمل‌های استاندارد انجام آزمایش (Sop) و سایر اقداماتی که در آزمایشگاه آنالیز اسپرم انجام می‌گیرد در یک کتابچه، بنام نظام‌نامه کیفیت (Quality Manual=QM) بصورت مکتوب جمع‌آوری می‌گردد. در QM، ساختار آزمایشگاه، مهارت‌های فنی مورد نیاز، چگونگی ارتباط بین پرسنل و سوپروایزر، الگوهای آموزش مداوم پرسنل و… ذکر می‌شود.

دستورالعمل‌های استاندارد برای انجام آزمایش (Sop): این دستورالعمل‌ها باید دقیقاً توسط پرسنل فنی اجرا شوند.

در پروتکل‌های Sop نحوه آگاه سازی بیماران از چگونگی گرفتن نمونه‌، روش‌های انجام آزمایش، چگونگی گزارش نتایج، روش‌های کنترل و کالیبراسیون دستگاه‌ها و ابزارآلات مورد استفاده (میکروسکپ، سانتریفوژ، پی‌پت‌ها و …) نحوه استفاده از چارت‌های کنترلی و چگونگی برخورد با نتایج خارج از کنترل آمده است.

کنترل کیفی داخلی (IQC):

از این برنامه جهت بررسی دقت نتایج استفاده می‌شود. برای اجرای IQC می‌توان از نمونه‌های کنترل کیفی تجاری استفاده نمود و یا آنها را در آزمایشگاه تهیه کرد که هر کدام دارای مزایا و معایبی هستند. نمونه‌های تجاری دارای یک میانگین و یک دامنه برای هر پارامتر بوده (مثلاً غلظت، مورفولوژی و …) و با آنها می‌توان هم دقت و هم صحت آزمایشات را بررسی کرد اما این کنترل‌ها معمولاً گران بوده و همه جا نیز در دسترس نمی‌باشند. کنترل‌هایی که در داخل آزمایشگاه تهیه می‌شوند ارزان بوده و هر آزمایشگاهی می‌تواند آنها را برای استفاده خود تهیه نماید اما با آنها فقط می‌توان دقت آزمایشات را بررسی کرد زیرا مقدار واقعی پارامترها معلوم نیست و لذا تعیین صحت با آنها مقدور نمی‌باشد.

در صورتی که از نمونه‌های تجاری استفاده می‌شود برای بررسی صحت باید به داده‌های شرکت سازنده استناد کرد اما برای کنترل دقت، هر آزمایشگاهی لازم است تا چارت‌های کنترل را برای خود ترسیم نماید.

توصیه می‌شود از نمونه‌های کنترل نرمال (مثلاً اسپرم با غلظت 50×106/ml) و پایین (مثلاً کنترل‌هایی که غلظت اسپرم کمتر از50×106/ml دارند) تواماً استفاده شود.

روش تهیه کنترل اسپرم در آزمایشگاه:

  • تهیه کنترل برای بررسی غلظت اسپرم:

بهتر است از یک نمونه منی برای تهیه کنترل استفاده شود زیرا در صورتی که بخواهیم چند نمونه را با هم مخلوط کنیم امکان ایجاد آگلوتیناسیون وجود خواهد داشت.

برای تهیه کنترل می‌توان یکی از نگهدارنده‌های زیر را به کار برد:

الف: فرمالین: به27ml آب مقطر، مقدار 10ml فرمالدئید%37 v/v اضافه نمایید.

ب: آزاید: مقدار19.5 g NaN3 را در 100ml آب مقطر حل نمایید.

ج: محلول مهار کنـنده آگلوتیناسیون APSIS: به100ml آب مقطر، 1g سرم آلبومین گاوی (BSA)، 2g پلی وینیل پیرولیدون (pvp)، 0.9 g کلرید سدیم، 0.1ml دترژانـــــــــت تریتون x-100، 0.004ml از silicone antifoaming agent و 1g سدیم آزاید اضافه کنید و پس از مخلوط کردن، با کاغذ صافی 0.45µm آن را فیلتر نموده و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

این محلول به دلیل داشتن سدیم آزاید سمی است. سدیم آزاید خاصیت باکتری‌کشی داشته و می‌توان آن را از محلول APSIS حذف کرد تا خاصیت سمی آن گرفته شود، اما در صورت آلوده شدن محلول به باکتری‌ها، باید آنرا دور ریخته و از محلول جدید استفاده نمود.

روش کار: ابتدا نمونه‌ای را که می‌خواهیم بعنوان کنترل استفاده نماییم شمارش نموده و پس از اینکه به خوبی مخلوط نمودیم با یکی از محلول‌های ذکر شده، مخلوط می‌کنیم و اگر از APSIS استفاده شود باید نمونه منی را سریعاً با آن مخلوط کرد زیرا هرچه این کار به تعویق بیفتد احتمال ایجاد کریستال در آن بیشتر شده و این پدیده، در زمان پر کردن لام‌های نئوبار ایجاد اشکال خواهد نمود.

مقداری از نمونه منی را به یک لوله سانتریفوژ 15 میلی‌لیتری منتقل کرده و به ازاء هر میلی‌لیتر آن، 100µL از فرمالین %10 یا 10µL آزاید و یا 1ml از محلول APSIS اضافه نمایید.

ترکیب حاصل را بخوبی مخلوط نموده، در ویال‌های 0.5 تا 1 میلی‌لیتری ریخته و درب آنها را محکم ببندید. هنگام تقسیم نمونه در داخل این ویال‌ها، باید دائماً آن را مخلوط نمائید تا مطمئن شوید نمونه توزیع شده در لوله‌ها یکسان است. لوله‌ها را در دمای 4̊c نگهداری کنید.

در هنگام استفاده از نمونه‌های کنترل باید آنها را رقیق نمود. میزان رقت بستگی به نگهدارنده‌ای دارد که استفاده شده است. مثلاً وقتی از APSISاستفاده می‌کنیم نمونه را در ابتدا با آن به نسبت 1/2=1+1 رقیق کرده‌ایم و هنگام کار اگر آن را مجدداً با آب مقطر به نسبت 1/10 رقیق نمائیم، رقت نهایی 1/20 خواهد بود. نمونه کنترل را مشابه نمونه واقعی شمارش می‌کنیم.

٭توجه: در هنگام کار برای عمل رقیق سازی از آب مقطر استفاده می‌شود.

اگر غلظت اسپرم‌های نمونه کنترل کم باشد (مثلاً در دامنه 4-25×106/ml) رقت نهایی 1/5 کافیست. در این حالت چون ابتدا نمونه را 1/2 با APSIS رقیق کرده‌ایم کافی است آن را با سه قسمت آب مقطر مخلوط کرده تا رقت نهایی 1/5 شود.

نمونه‌های کنترل که با نگهدارنده تهیه شده‌اند به مدت حداقل 6 ماه در یخچال پایدارند.

  • تهیه کنترل برای بررسی مورفولوژی و میزان زنده بودن اسپرم:

نمونه را بخوبی مخلوط کرده و سپس 10µL از آن را روی سطح لامی که بخوبی تمیز کرده‌ایم ریخته و گسترش تهیه می‌نماییم. گسترش‌های حاصل را پس از خشک شدن به روش پاپانیکولا (برای کنترل مورفولوژی) و ائوزین- نیگروزین (برای بررسی میزان زنده بودن اسپرم) رنگ آمیزی نموده و سپس مانته می‌کنیم. بدین ترتیب کیفیت لام‌ها تا چند سال حفظ خواهد شد.

  • تهیه کنترل برای بررسی حرکت اسپرم:

برای این کار از ویدیوهای ضبط شده می‌توان استفاده کرد. این ویدیوها را می‌توان در اختیار پرسنل فنی قرار داده و نتایج حاصل از گزارشات آنها را ارزیابی نمود. تصاویر حرکت حداقل 400 اسپرم را از فیلدهای مختلف باید ضبط نمود. هر فیلد با یک کد مشخص می‌شود (مثلاً 01) و 15 ثانیه از آن فیلمبرداری می‌شود، سپس 3 ثانیه فیلمبرداری بلانک انجام می‌شود؛ بدین ترتیب که وقتی دوربین روشن است درب لنز را می‌بندیم تا فاصله‌ای بین این فیلد و فیلد بعدی ایجاد شود. اولین فیلد در قسمت بالا و چپ لام انتخاب می‌شود و باید حدود 5mm هم از لبه لام فاصله داشته باشد. سپس به طرف راست، پائین، چپ و بالا می‌رویم و فیلمبرداری را به روش ذکر شده انجام می‌دهیم تا حداقل 400 اسپرم شمارش شود.