معماری
سمپلر

کنترل کیفی سمپلر (میکروپیپت)

نحوه کالیبراسیون سمپلر,سمپلر چیست,انواع سمپلر,کار با سمپلر,قیمت سمپلر,سر سمپلر,کنترل کیفی لوپ,سمپلر آزمایشگاهی چیست

پس از محکم کردن نوک سمپلر مناسب به سمپلر ، ابتدا  دکمه کنترل / فشار (Control button/Push button) سمپلر را به آرامی تا توقف اول دکمه، پائین می آوریم ، در همان حال نوک سمپلر را چند میلیمتر(حدود ۳ میلی متر وبسته به حجم سمپلر) در مایع فرو برده و دکمه فشار را به آرامی رها می‌کنیم تا مایع وارد نوک سمپلر  شود، برای تخلیه در لوله یا ظرف مورد نظر ، با فشار مجدد دکمه تا توقف اول، محلول را با تماس به جداره ظرف به آرامی خارج کرده و پس از ۳-۱ ثانیه با فشار تا توقف دوم ، باقیمانده محلول را نیز کاملاً خارج می‌نمائیم.

جهت رسیدن به حداکثر دقت و صحت  برای سمپلرهای با حجم ۱۰ میکرولیتر و بیشتر ، توصیه می شود قبل از انتقال حجم نمونه ، ۲ الی۳ بار عمل برداشت و تخلیه از نمونه تکرار شده تا کاملا جدار داخلی نوک سمپلر به نمونه آغشته شود  و سپس حجم مورد نظر از نمونه منتقل شود.

برای حجم های کمتر از ۱۰ میکرولیتر بهتر است، فقط یکبار برداشت با نوک سمپلر Unwetted Tip که خشک و بدون آغشتگی به نمونه باشد، انجام شده و پس از تخلیه در محل مورد نظر، جهت اطمینان از تخلیه کامل تمامی حجم درون نوک سمپلر، با محلول موجود در ظرف شسته شود.

باید در نظر داشت، عملکرد مطلوب سمپلر فقط با استفاده از سر سمپلر های نو و یکبار مصرف بدست می آید و از شستشو و استفاده مجدد از سر سمپلرها، می‌بایست خودداری نمود.

نکات مهمی که  در کار با سمپلرمی‌بایست رعایت شود، عبارتند از :

۱-  اطمینان از اتصال کامل نوک سمپلر به سمپلر

۲-  عمود نگهداشتن سمپلر در زمان مکش

۳-  تخلیه محلول با تماس نوک سمپلر به جداره ظرف تحت زاویه ۱۰ تا ۴۰ درجه

۴-  رها کردن آرام دکمه در زمان پر یا خالی کردن محتویات نوک سمپلر

۵-  کشیدن کناره های خارجی نوک سمپلر پس از انجام مکش به جداره های فوقانی لوله به منظور حذف قطرات خارجی نوک سمپلر یا در صورت نیازخشک کردن قطرات باقی مانده در بخش خارجی آن به کمک پارچه ای بدون پرز(البته باید مطمئن شد که پارچه چیزی از محتویات داخل نوک سمپلر را به خود جذب نکند)

۶-  هنگام تخلیه محلول پس از توقف اول (پائین آوردن دکمه کنترل تا مرحله اول) باید کمی تامل کرد (۳-۱ ثانیه) و سپس دکمه را تا توقف دوم پائین آورد.

۷-  درسمپلرهای متغیر (قابل تنظیم برای حجم های مختلف ) توصیه می شود برای کاهش حجم و تنظیم حجم مورد نظر ، دکمه کنترل به آرامی تارسیدن به حجم انتخابی، چرخانده شود .

برای افزایش حجم بهتر است دکمه کنترل را تا کمی بیش از حجم مورد نظر پیچاند و بعد در خلاف جهت با کم کردن حجم به مقدار مورد نظر رسید.

 

کنترل کیفیت سمپلر( میکروپیپت ):

اطمینان از کالیبراسیون صحیح میکرو پیپتها که ازطریق بررسی دقت و صحت عملکرد میکرو پیپت در برداشت حجم مورد انتظار حاصل میشود ، نقش مهمی در برنامه های تضمین کیفیت ایفامیکند. اگرچه  این ارزیابی  به دو روش توزین و رنگ سنجی قابل انجام است، ولی تحت شرایط موجود و به علت عدم دسترسی اغلب آزمایشگاهها به الزامات استفاده از روش توزین مانند ترازوهایی با درجه تفکیک (Resolution) مناسب برای کنترل سمپلر (درجه تفکیک  ۰۱/۰ میلی گرم ) و کالیبراسیون منظم ترازو ، استفاده از  روش رنگ سنجی، توصیه می‌گردد.

بررسی دقت و صحت سمپلر بهتراست  ۳ تا ۴ بار در سال انجام شود.

ارزیابی سمپلر (میکروپیپت) به روش رنگ سنجی

در این روش با استفاده از یک محلول رنگی با جذب پایدار، مثل رنگ سبز خوراکی در طول موج ۶۳۰-۶۲۰ نانومتر و یا پارانیتروفنل در طول موجهای ۴۰۱ یا ۴۰۵ نانومتر ، صحت عملکرد سمپلر  ونیز قابلیت تکرار آن  کنترل می شود.

مواد و ابزار مورد نیاز :

۱- ماده رنگی  :

·         رنگ سبز خوراکی

یا

·         پارانیترو فنلParanitrohenol (C6H5NO3), indicator PH(5.4-7.5) MERCK Art. 6798

(جذب نوری بدست آمده از پودر پارانیتروفنل (اندیکاتور) استفاده شده در این دستورالعمل با مقادیر قید شده برای High purity- NIST SRM 938 Paranitrophenol مندرج در کتاب Tietz 1999  قابل انطباق است.)

۲ –  هیدروکسید سدیم  ۰۱ / ۰ نرمال ،محلول کاری برای رقت سازی پارانیترو فنل .

.  Sodium hydroxide(NaOH) , Pure … MERCK Art. 6462

۳- لوازم شیشه ای کلاس A  با توجه به حجم مورد نیاز در تهیه غلظت محلول رنگی(از قبیل بالن ژوژه و پیپت )

۴- فتومتر دارای طول موجهای ۴۰۱یا  ۴۰۵ برای پارانیترو فنل  و ۶۲۰یا ۶۳۰ نانومتر برای رنگ سبز خوراکی

۵- لوله آزمایش

۶- ترازو ( کالیبره و تحت کنترل )

۷- نوک سمپلر مناسب

۸- آب مقطر

نکته : طول موج انتخابی برای قرائت محلول پارانیتروفنل ۴۰۱ نانومتر است ولی امکان قرائت در ۴۰۵ نانومتر نیز وجود دارد.

 

روش کار :

همانطور که گفته شد انجام روش رنگ سنجی با استفاده از پودررنگ سبز خوراکی و نیز پارانیتروفنل امکانپذیر میباشد، لذا نحوه تهیه هردومحلول ذخیره (stock)  ذیلا بیان شده است .قابل ذکر است درسالهای اخیر رنگ سبز خوراکی بعضا بصورت ناهمگون ویا محلول  عرضه شده که در این موارد، دستورالعمل زیر کاربرد نداشته و بهتر است از پارانیترو فنل استفاده شود.

بطور معمول سمپلرها به سه گروه    الف) ۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتر ،       ب) ۱۰۰-۱۰ میکرولیتر     پ) حجمهای کمتر از ۱۰ میکرولیتر،  تقسیم می شوند.

 برای هریک از گروههای فوق می‌بایست باید یک محلول ذخیره از” رنگ “تهیه نمود . از آنجایی که اغلب فتومترها بهترین عملکرد خود را در  محدوده جذبی ۴ /۰  نشان میدهند محلول های ذخیره رنگی با غلظتی تهیه میشوند که پس از مرحله رقیق شدن  دارای جذبی در حدود ۴/۰ باشند.

۱-طرز تهیه محلول رنگی ذخیره رنگ سبز خوراکی برای هرگروه ازسمپلرها :

 

سمپلرهای گروه الف (۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتر):   ۵/۱۵ میلی گرم پودر رنگ سبزدر ۱۰۰ میلی لیترآب مقطر حل شود.( غلظت رنگ در محلول ذخیره این گروه، ۵/۱۵میلی گرم درصد است)

سمپلرهای گروه ب ( ۱۰۰-۱۰ میکرولیتر):  ۱۵۵ میلی گرم پودر رنگ سبز در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شود.( غلظت رنگ در محلول ذخیره این گروه، ۱۵۵میلی گرم درصد است)

سمپلرهای گروه پ ( سمپلرهای کمتر از ۱۰ میکرولیتر) : ۵۵/۱ گرم از پودر رنگ سبز در ۱۰۰ میلی لیتر آب حل شود. (غلظت رنگ در محلول ذخیره این گروه ۵۵/۱ گرم درصد یا۱۵۵۰میلیگرم درصد است )

۲ -طرز تهیه محلول رنگی ذخیره پارانیتروفنل برای هر گروه از سمپلرها :

 

سمپلرهای گروه الف (۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتر): ۴۲ میلی گرم پودر پارانیتروفنل، در یک لیتر آب مقطر، حل می‌شود. .( غلظت رنگ در محلول ذخیره این گروه، ۴۲میلی گرم درلیتر است)

سمپلرهای گروه ب ( ۱۰۰-۱۰ میکرولیتر):  ۴۲ میلی گرم پودر پارانیتروفنل، در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر، حل می‌شود. .( غلظت رنگ در محلول ذخیره این گروه، ۴۲میلی گرم درصد است)

سمپلرهای گروه پ ( سمپلرهای کمتر از ۱۰ میکرولیتر) :  ۴۲۰میلی گرم پودر پارانیتروفنل ، در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر، حل می‌شود. .( غلظت رنگ ذخیره این گروه، ۴۲۰میلی گرم درصد است)

 ارزیابی دقت

برای بررسی دقت عملکرد سمپلر وبعبارتی سنجش مقدار عدم دقت یا قابلیت تکرار، ابتدا محلول ذخیره  رنگی مناسب طبق روش ذکرشده و باتوجه به حجم سمپلر مورد کنترل، تهیه می گردد سپس ده لوله در جالوله ای چیده و با استفاده از پی پت کلاس A و بر مبنای  جدول (۱-۱)  مقدار مشخص آب مقطر(در صورت استفاده از رنگ سبز) ویا سود ۰۱/۰ نرمال( در صورت استفاده از پارانیتروفنل)، با دقت بسیار زیاد  در هر لوله ریخته می شود. سپس با استفاده از سمپلر مورد کنترل ، از محلول ذخیره رنگی برداشت شده و به هر لوله اضافه می شود . پس از مخلوط کردن، میزان جذب نوری لوله ها در مقابل بلانک مناسب(آب مقطربرای سبز خوراکی وسود برای پارانیتروفنل)قرائت می‌گردد .همانگونه که قبلا ذکر شد طول موج انتخابی برای قرائت جذب نوری رنگ سبز خوراکی ۶۲۰ یا۶۳۰ نانومتر وبرای پارانیتروفنل ۴۰۱ یا۴۰۵ نانومتر میباشد.

توجه  :   در صورت استفاده از محلول ذخیره پارانیترو فنل ، رقتهای مورد نیاز طبق جدول ۱ میباید در سود ۰۱/۰ نرمال تهیه شود . در حالیکه برای رنگ سبز خوراکی از آب مقطر استفاده می‌شود.

جدول (۱-۱)

گروه سمپلر

حجم سمپلر مورد کنترل برحسب میکرولیتر

آب مقطر یاسود ۰۱/۰ نرمال برداشتی

توسط پی پت برحسب میلی لیتر

حجم رنگ برداشتی از محلول ذخیره توسط سمپلر برحسب میکرولیتر

رقت حاصله

گروه پ

۵

۵

۵

۱۰۰۱/۱

گروه ب

۱۰

۱

۱۰

۱۰۱/۱

گروه ب

۲۰

۲

۲۰

۱۰۱/۱

گروه ب

۲۵

۵/۲

۲۵

۱۰۱/۱

گروه ب

۵۰

۵

۵۰

۱۰۱/۱

گروه ب

۱۰۰

۱۰

۱۰۰

۱۰۱/۱

گروه الف

۲۰۰

۲

۲۰۰

۱۱/۱

گروه الف

۵۰۰

۵

۵۰۰

۱۱/۱

گروه الف

۱۰۰۰

۱۰

۱۰۰۰

۱۱/۱

سپس میانگین و انحراف معیارخوانده های جذب نوری(OD ) 10لوله ، محاسبه و ضریب انحراف خوانده‌ها (CV%) بدست می‌آید.

 CV  : ضریب انحراف (Coefficient of variation)

SD: انحراف معیار

mean : میانگین جذب نوری لوله‌ها

 n: تعداد خوانده‌ها

xi : جذب نوری هر لوله

در صورت انتقال صحیح حجم آب ویا سود ، اختلاف در جذب نوری  لوله های حاوی محلول رنگی به اختلاف در حجم برداشت شده توسط سمپلر، نسبت داده  شده و  درصد ضریب انحراف خوانده‌ها (CV%)  معرف قابلیت تکرار‌پذیری و مقدار عدم دقت سمپلر خواهد بود.

 ارزیابی صحت

جهت کنترل صحت عملکرد سمپلر و تهیه معیار سنجش صحت در روش رنگ سنجی ، باید با استفاده از ابزار شیشه ای کالیبره، محلولی دارای رقت مشابه با رقت تهیه شده  توسط سمپلر تهیه شود. (۱۰۰۱/۱) یا( ۱۰۱/۱)  ویا(۱۱ /۱)

 بدین منظور با پی پت کلاس A، مقداری از محلول رنگی ذخیره (متناسب با  گروه حجمی سمپلرو طبق روش ذیل)، به بالن ژوژه کلاس A ای که تا خط نشانه از آب مقطر پر شده اضافه میشود .

روش تهیه محلولهای کنترل صحت :

کنترل صحت گروه پ ( سمپلرهای کمتر از ۱۰ میکرولیتر ) رقت ۱۰۰۱/۱:

بالن ژوژه یک لیتری را برای سبز خوراکی با آب مقطر و برای پارانیتروفنل با سود ۰۱/۰ نرمال  به حجم رسانده سپس با پی پت کلاس A ، ۱ میلی لیتر از رنگ ذخیره ( گروه پ ) به آن اضافه و مخلوط نمائید.

کنترل صحت گروه ب (سمپلرهای ۱۰-  ۱۰۰   )  رقت ۱۰۱/۱   :  

 بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتری را برای سبز خوراکی با آب مقطر و برای پارانیتروفنل با سود ۰۱/۰ نرمال به حجم رسانده سپس با پی پت کلاس A ،  ، ۱میلی لیتر از رنگ ذخیره (گروه ب) به آن اضافه و مخلوط نمائید .

   کنترل صحت گروه الف (سمپلرهای ۱۰۰-۱۰۰۰ )  رقت ۱۱/۱  : 

بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتری را برای سبز خوراکی با آب مقطر و برای پارانیتروفنل با سود ۰۱/۰ نرمال به حجم رسانده سپس با پی پت کلاس A ، ۱۰میلی لیتر از رنگ ذخیره ( گروه الف ) به آن اضافه و مخلوط نمائید.

نکته : هرگاه برای اضافه کردن ۱۰میلی لیتر رنگ، در بالای خط نشانه  فضای خالی وجود نداشت ، تاجائیکه امکان دارد از حجم ۱۰میلی لیتر به بالن اضافه نموده و بقیه را به داخل بشر منتقل میکنیم . پس از مخلوط نمودن کامل محتویات بالن ژوژه ، همه حجم را به بشر اضافه نموده و با محتویات بشر ، بالن ژوژه را چند بار شستشو میدهیم.

 پس از اطمینان از یکنواختی  محلول صحت تهیه شده ، محلول حداقل در سه لوله ریخته و جذب نوری هر سه لوله قرائت می‌شود  . میانگین خوانده ها بعنوان معیار مقایسه صحت دربررسی صحت عملکرد سمپلر استفاده میشود .

شاخصه صحت (Bias) است که از فرمول زیر بدست می آید:

× ۱۰۰

 expected : میانگین جذب نوری ۳خوانده ازمحلول تهیه شده در بالن ژوژه

observed : میانگین جذب نوری ۱۰ لوله که در مرحله ارزیابی عدم دقت بدست آمده است.

توجه  : به منظور به حداقل رساندن عوامل ایجاد خطا بهتر است بررسی دقت و صحت در یک روز انجام گیرد .

مقادیر مجاز عدم دقت و عدم صحت : 

اولین معیار مقایسه برای کنترل کیفیت سمپلرها، میزان ادعا شده توسط سازندگان سمپلر برایInaccuracy (Bias) و (CV% )  Imprecision میباشد  . چرا که بدنبال ارتقای فنآوری ابزار آزمایشگاهی  و بهبود کیفیت عملکرد ابزار ، مقادیر عدم صحت و عدم دقت ادعائی سازند گان میکرو پیپتها نیز بسیار کاهش یافته است .

 با توجه به  مختصات کیفیتی بسیاری از میکرو پیپتها ،  حداکثر میزان قابل قبول عدم دقت  ۲%  =CV% و حداکثر میزان قابل قبول عدم صحت۳% =Bias%   پیشنهاد میشود .

نکته: معیارهای یاد شده که با توجه به تنوع سمپلرهای مورد استفاده آزمایشگاهها انتخاب شده است، اگرچه از معیارهای مجاز اعلام شده قبلی کوچکتر میباشد ولی هنوز با میزان قابل قبول برخی مراجع بین المللی  فاصله زیادی دارد.

تنظیم

در برخی از انواع سمپلرها که حجم ثابتی را برداشت می‌نمایند(سمپلرهای Fixed Volume ) در صورت وجود Bias غیرقابل قبول، می‌توان با استفاده از اطلاعات مندرج درراهنمای سمپلر،  حجم  برداشتی را تصحیح نمود.

در مورد تنظیم سمپلرهای متغیر باید توجه داشت که هرگونه تغییر در حجمهای مختلف ، به میزان ثابت اعمال میشود . بدین معنی که تغییر ۱ میکرو لیتر در حجم  ۱۰۰میکرولیتر   (۱% تغییر )  ، در حجم۱۰ میکرولیترنیز باعث ۱ میکرو لیتر تغییر، (  یعنی ۱۰%   تغییر  ) خواهد شد. لذا بهتر است عمل تنظیم کالیبراسیون توسط شرکت معتبر انجام شود.

نحوه نگهداری سمپلر:

نگهداری سمپلر بر اساس دستورالعمل سازنده انجام می‌پذیرد ولی مطالب ذیل در موردبیشتر انواع سمپلر صادق می‌باشد.

•                       کلیه قسمت های خارجی اغلب سمپلرها را می توان با محلول صابون تمیز کرد و پس از آبکشی با آب مقطر در دمای اتاق خشک نمود.

•                       برای ضدعفونی کردن ، محلول ۶۰% ایزوپروپانل توصیه می شود. برخی از انواع سمپلر نیز قابل اتوکلاو هستند.

•                       پس از شستشوی سطوح خارجی و تمیزکردن بخش نگهدارنده نوک سمپلر “Tip holder” (که به کمک میله همراه یا با سوآب آغشته به اتانل ۷۰ درجه انجام می گیرد) باید پیستون با مقدار کمی از روغن همراه سمپلر،که اغلب Silicone grease میباشد ، روغن کاری شود.

•                       برای تمیز کردن قسمتهای داخلی سمپلر باید به راهنمای همراه سمپلر مراجعه شود.

نکات مهم :

۱-  ضربه به سمپلر می تواند این وسیله را از کالیبراسیون خارج نماید.

۲-     با انتخاب سر سمپلر مناسب، حجم محلول برداشتی باید در حدی باشد که مایع وارد قسمتهای داخلی نگردد.

۳-                       تماس دست با نوک سمپلر آلوده ممنوع است.

۴-     در صورت مکش محلول های  اسیدی و سایر مواد با خاصیت خورندگی باید بخش نگهدارنده نوک سمپلر (Tip-holder) باز شده و پیستون و حلقه پلاستیکی (O-ring)  بخوبی با آب مقطر شسته شود.

۵-                       هرگز نباید سمپلر حاوی محلول به پهلو روی میز گذاشته شود.

۶-     هرگز نباید سمپلرهای متغیر را بر روی حجمی خارج از محدوده حجم ادعائی آن تنظیم کرد.

پاسخ دهید