معماری

واكنش زنجير پليمراز (PCR)

تكنيك PCR در اواسط دهه 1980 توسط كري موليس معرفي شد و باعث تحول مهمي در بيولوژي شد. با اين روش مي‌توان قطعات DNA از سلول‌هاي مختلف و نمونه‌هاي بيولوژيك مجهول و مشكوك، زنجير مفرد DNA با ملكول‌هاي RNA و حتي DNA از يك سلول تنها را تكثير نمود. اسيدهاي نوكلئيك اين منابع به عنوان الگو براي سنتز DNA عمــــل مي‌كنند. اين روش جايگاه ويژه‌اي در میکروب شناسی تشخيصي، ویروس‌شناسی و پزشكي قانوني براي مشاهده و تكثير قطعات مهم تشخيص از ملكول‌هاي DNA مفيد است و امروزه روش‌هاي مختلف PCR جهت تشخيص عوامل ميكروبي قابل كشت و غير قابل کشت در آزمايشگاه‌هاي مدرن انجام مي‌گيرد و يك روش تشخيصي سريع عوامل میکروبی مي‌باشد. با اين روش مي‌توان موارد زير را مورد بررسي قرار داد:

1- مشاهدات توالي خاصي از DNA پاتوژن‌هاي خاص

2- مشاهدات تغييرات ژنتيكي

3- غربالگري اختلالات ژنتيكي

4- تهيه نسخه‌هاي متعدد از يك ژن

روش PCR بسيار حساس است. در اين روش با استفاده از يك ميكروگرم از کل ژنوم DNA موجود زنده مي‌توان يك تا دو ميلي‌گرم ازDNA مورد نظر را ساخت، حتي اگر DNA مورد نظر، درصد بسيار كمي از كل DNA بوده باشد. در هر حال تكثير يك فرآورده مي‌تواند تحت تأثير شرايطي نظير غلظت كاتيون مورد نياز براي فعاليت آنزيم، وجود مهار كننده‌هاي پلي‌مراز و تعداد چرخش‌هاي بكار رفته در طي عمل PCR قرار گيرد. اين روش به ويژه در تكثير قطعه‌اي از DNA كه بين دو منطقه از توالي شناخته شده قرار گرفته مفيد است.

اختصاصي بودن اين روش به استفاده از پرايمرهاي اليگونوكلئوتيد سنتزي بستگي دارد. پرايمرها، قطعات كوتاهي از زنجير تكي DNA (15 تا 30 جفت باز) بوده كه براي توليد يك مولكول داراي توالي خاص نوكلئوتيدي سنتز شده‌اند. دو پرايمر(F،R ) معمولاً در روش PCR به كار مي‌روند كه هر كدام توالي‌هاي متفاوتي دارند. به طوري كه توالي پرايمرها مكمل توالي‌هايي هستند كه در زنجير DNA الگو قرار دارند.

خصوصيات ديگر پرايمرهاي ايده‌آل شامل موارد زير است:

1- تا آنجا كه ممكن است فاقد مناطق غني از GC و AT باشد.

2- فاقد ساختمان ثانويه داخلي (لوپ‌ها) باشد.

3- فاقد پرايمر مكملي به ويژه در انتهاي باشد.

4- عامل ديگري كه در انجام PCR به طور مؤثري تأثير مي‌گذارد، حرارت اتصال پرايمر به توالي هدف (annealing) است.

دو پرايمر مورد استفاده در روش PCR دو عمل انجام مي‌دهند؛ اول اينكه محل ژني كه بايد تكثير شود را مشخص مي‌نمايند و دوم اينكه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي‌كنند. عمل اول كاملاً مشخص است، در مورد عمل دوم بايد گفت كه وقتي اين دو شناساگر به دو ناحيه مختلف DNA و به سمت هم قرار مي‌گيرند DNA پلي‌مراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانند سازي مي‌كند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده تعيين مي‌شود.

لازم بذكر است كه طراحي پرايمر يكي از اصلي‌ترين مراحل روش PCR مي‌باشد و همانطوركه در بالا اشاره شد اختصاصي بودن روش PCR بستگي به استفاده از پرايمرهاي ايده‌آل دارد، لذا بايستي براي عوامل میکروبی كه احتمال آنها در نمونه‌های بالینی وجود دارد پرايمرهاي مناسب طراحي گردد تا بتوان آن را سریعاً شناسائی کرد.

روش PCR با استفاده از DNA پلي‌مراز پايدار در برابر حرارت Taq) پلي‌مراز) كه از باكتري گرمادوست به نام Thermus aquaticus بدست آمده است و ماشين‌هايی كه به طور اتوماتيك، حرارت ضروري براي هر چرخه را در PCR فراهم مي‌سازند تسهيل شده است. Taq پلي‌مراز، آنزيمي مناسب است زيرا در چرخه‌هاي حرارت بالا (94 درجه سلسیوس) فعال باقي مي‌ماند و فرآورده‌هاي عالي و كافي از DNA هاي كوتاه را فراهم مي‌سازد. در هر حال، توالي‌هاي دراز DNA (براي مثال 2 كيلو باز) نيز مي‌تواند به سادگي بوسيله اين روش تكثير يابد.

براي شروع DNA PCR الگو (نمونه مجهول، پرايمرها و نوكلئوتيدهای تري‌فسفات (dCTP، dTTP، dATP، dGTP) براي ساختن و تكثير DNA، Taq پلي‌مراز براي تكثير DNA جديد، يون‌هاي منيزيم مورد نياز براي فعاليت آنزيم در يك لوله با هم مخلوط مي‌شوند، سپس لوله را گرم مي‌كنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند و در مرحله بعد با سرد کردن لوله حاوی محتویات فوق به پرايمرها این اجازه داده می‌شود که به نواحي مورد نظر متصل شده و DNA پلي‌مراز (آنزيم Taq) شروع به همانند سازي از روي DNA الگوي تك‌رشته‌اي بنمايد. بعد از مدت لازم براي همانند سازي بار ديگر پرايمرها به نواحي مكمل خود متصل می‌شوند. چون در مرحله قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است، در اين مرحله چهار رشته الگو براي همانند سازي وجود دارد و در نتيجه در پايان اين مرحله چهار نسخه از ژن مورد نظر حاصل مي‌شود، بار ديگر سيستم گرم مي‌شود و در اينجا هشت نسخه به وجود مي‌آيد و در مرحله بعد 16 نسخه و به همين صورت بطور تصاعدي تعداد نسخه‌هاي ژن‌ها زياد مي‌شود. بطور كلي پس از n تكرار مادر محلول 2n نسخه از ژن مورد نظر خواهيم داشت. مثلاً پس از 20 بار تكرار ما 2n يعني 262144 نسخه و پس از 30 بار تكرار 268435456 نسخه ايجاد خواهد شد كه خيلي بيشتر از نيازهاي معمولي براي انجام كارهاي زيست شناسي مولكولی مي‌باشد (شکل1) .

شکل1: سیکل های مختلف PCR

 1

لازم بذكر است كه در ابتداي طراحي PCR از آنزيم DNA پلي‌مراز اشریشیا کلی استفاده مي‌شد، ولي اين آنزيم به حرارت حساس بوده و پس از هر بار حرارت دادن محيط واكنش تا دماي 94 درجه سلسیوس، افزودن دوباره آنزيم تازه به محيط لازم بود. يكي از مهم‌ترين كشفيات در اين زمينه اين بود كه آنزيم Taq پلي‌مراز از باكتري گرمادوست جدا شده و اين آنزيم مقاوم به گرما مي‌باشد. اين آنزيم در 94درجه سلسیوس پايدار است ولي درجه حرارت اپتيم آن72 درجه سلسیوس مي‌باشد. اين آنزيم باعث شد كه به راحتي PCR به صورت اتوماتيك انجام شود و با افزودن يكبار آنزيم Taq پلي‌مراز ديگر نيازي به اضافه كردن مجدد آن نباشد.

مزيت بسيار مهم ديگر Taq پلي‌مراز افزايش حساسيت و دقت PCR مي‌باشد. در دماي پائين (30درجه سلسیوس كه براي DNA پلي‌مراز اشریشیا کلی بكار مي‌رفت) پرايمرها ممكن است به جايگاه‌هايي كه توالي تا حدودي مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دماي پائين تعداد كمتري پيوند هيدروژني براي اتصال پرايمرها نياز است، بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحي نسبتاً مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR مي‌شوند. ولي وقتي كه واكنش در دماي 72 درجه سلسیوس (دماي اپتيم فعاليت Taq پلي مراز) انجام شود اتصال پرايمرها به نواحي غيراختصاصي كاهش مي‌يابد. به اين صورت پس از پايان PCR رشته‌هاي DNA كاملاً مشابه و خالص بدست خواهد آمد. براي ديدن قطعات تكثير شده DNA مي‌توان به راحتي از ژل الكترفورز و رنگ‌آميزي اتیديوم برومايد استفاده كرد. در شكل زير مراحل حرارت‌دهي و زمان حرارت دهي را نشان مي‌دهد. هرچند که این دماها و مدت زمان، بیشتر به عوامل مختلف مانند پرایمر می‌تواند متفاوت باشد.

شکل2: دما و زمان‌های مختلف سیکل‌های PCR

2

همانطور كه يادآوري شد، روش PCR به ويژه در میکروب شناسی تشخيصي مفيد مي‌باشد. براي مثال روش‌هاي توسعه يافته است كه مشاهده وجود ميكروارگانيسم بيماري‌زاي باسيلوس آنتراسيس را مقدور ساخته است. در اين روش‌ها تكثير از يك قطعه DNA (DNA نمونه) كه نشان دهنده وجود ژن براي مثال ژل پلاسيمد كد كننده كپسول اين باكتري است مقدور مي‌باشد. اين ژن نوعي كپسول پروتئيني توليد مي‌كند كه توسط باسيل آنتراكس بيماري‌زا بيان مي‌شود.

امروزه واكنش PCR در ماشين حرارتي ( ترموسایکلر) انجام مي‌شود. اين ماشين را مي‌توان براي چرخش‌هاي حرارت‌هاي پي‌در‌پي كه در شکل 2 نشان داده شده است برنامه‌ريزي كرد. در اولين مرحله چرخش (Denaturation) زنجيره مضاعف DNA مورد نظر در 94 درجه سلسیوس از هم جدا مي‌شوند كه در مرحله اول در 5 دقيقه ولي براي مراحل بعدي اين عمل در 30 ثانيه انجام مي‌گردد. سپس پرايمرهاي اختصاصي برای DNA هدف، اتصال (Annealing) به الگوها را در 65-30 درجه سلسیوس و متوسط 55 درجه سلسیوس مقدور مي‌سازد. هنگامي كه پرايمرها متصل شدند(Annealing)، تكرار Extension) سنتز (DNA از انتهاي از پرايمرها در 72 درجه سلسیوس رخ مي‌دهد. اين عمل به تشكيل دو مولكول از زنجيره مضاعف DNA منجر مي‌شود كه با تكرار مراحل فوق مي‌توان تعداد نسخه‌هاي مورد نظر را بدست آورد.

 

دكتر رضا ميرنژاد: باكتريولوژيست‏، استاديار دانشگاه

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی