معماری

آزمایشات تشخیصی تب مالت

بروسلا ها باکتری های کوچک گرد یا بیضوی کوکوباسیلی گرم منفی و غیر متحرک می باشند. تولید اسپور و کپسول و فلاژل یا فیمبریا نمی کنند.در بعضی منابع از وجود کپسول بسیارظریف در باکتری تهیه شده از کشت تازه با رنگ آمیزی مناسب ذکر شده است.(۲) بین ۰٫۵ -۰٫۷ میکرومترعرض و ۰٫۶-۱٫۵ میکرومتر طول دارند.به صورت تک , دوتایی, زنجیره های کوتاه یا خوشه های کوچک دیده می شوند.(۱و۳)
در رنگ آمیزی گرم منفی هستند, معمولا به صورت دو قطبی رنگ نمی گیرند.اسید فست نیستند ولی دربرابر رنگ بری با اسید و بازهای ضعیف مقاومت نشان می دهند.یک روش تغییر یافته اسید فست  برای رنگ آمیزی جفت و اجزای دیگر سقط طراحی شده است.(۳)
کشت و متابولیسم وفیزیولوژی
به صورت هوازی رشد می کندولی در بعضی موارد وجود  CO2 باعث افزایش رشد میشود. بیشتر گونه ها بر روی پپتون رشد کمی دارندولی با اضافه نمودن سرم به این محیط رشد باکتری افزایش می یابد.بروسلا کربوهیدرات ها را تخمیر نمی کنند.کاتالاز و اکسیداز مثبت هستند  ولی گونه   های اکسیداز منفی هم گزارش شده است .(۳)
طبقه بندی بروسلا ها : بروسلا ها توسط آزمون های ذیل به گونه و بیوتیپ های کوچکتر تقسیم می شوند.۱– نیاز به CO2 2ـ تولید H2S 3-  ممانعت از رشد توسط رنگ های باکتریواستاتیک
۴- آگلوتیناسیون با سرم های اختصاصی ۵- لیز شدن توسط باکتریوفاژها  (۳)
ساختمان آنتی ژنیک
آنتی سرم تهیه شده از حیواناتی که توسط کلنی های تازه باکتری ایمیونیزه شده اند قادر است هر سه گونه آبورتوس و ملی تنسیس و ْوئیس را آگلوتینه کند.(۲)
آگر آین آنتی سرم را با گونه ملی تنسیس مجاور کنیم مایع رویی پس از انکوباسیون تنها توانائی واکنش با گونه آبورتوس و سوئیس را دارد .اگر همین آزمایش را با گونه آبوتوس انجام دهیم تنها با ملی تنسیس واکنش نشان میدهد.(۱)
دو شاخص آنتی ژنیک در تست های سرولوژیک مشخص شده است. آنتی ژن) A  غالب در گونه
آبورتوس) و آنتی ژن M( غالب إر گونه ملی تنسیس) که البته آنتی ژن a در ملی تنسیس و آنتی – ژنm درآبورتوس وجود دارد. این آنتی ژن ها در کمپلکس لیپوپلی ساکارید- پروتئین عرضه میگردند.(۲)
ترکیب ۱۹ کربنی سیکلو پروپان اسید در تمام گونه ها بجز برسلا کانیس وجود دارد . این ترکیب در روش Gas – Liquid – Chromatography قابل تشخیص است و مبنای تست سریع GLC است.(۱)
ساختمان آنتی ژنیک بروسلا با تعدادی از باکتری ها دارای واکنش متقاطع است . مهمترین آنها عبارتند از : ۱- یرسینسا انترکولیتیکا ۲- فرانسیسلا تولارنسیس ۳- سالمونلا ۴- اشرشیا کولی
۵- ویبریو کلرا (۱)
افرادی که واکسن وبا دریافت کرده باشند آزمون رایت در آنها مثبت می شود.(۵)
ایمنی شناسی تب مالت
در این بیماری نیز مانند سایر بیماری ها در اواخر هفته اول ویا دوم مرحله حاد ابتدا بتدریج IgM و سپس IgG اختصاصی بر علیه شاخص های آنتی ژنیک باکتری بالا می رود و پس از چند هفته عیار
IgG از IgMنیز بیشتر می شود. در صورتی که درمان مناسب انجام شود تیتر IgG کاهش می یابد ولی تغییری در تیتر IgMایجاد نمی شود.حال چنانچه درمان مناسبی انجام نشود بیماری وارد مرحله مزمن شده و تیتر مثبت سرم به طور مشخص مربوط به آنتی بادی از کلاس IgGمی باشد. (۵)
البته مثبت شدن آنتی بادی در سرم بیمار از باکتریمی یا بازگشت عفونت جلوگیری نمی کند ودر محدود کردن بیماری نقشی را ایفاء نمی کند. (۲)
ایمنی سلولی نقش مهمی را در محدود شدن بیماری و فعالیت ماکروفاژها بر علیه میکروب های درون سلولی بازی می کند.(۲)
چنانجه درمان انجام نشود بیماری وارد مرحله تحت مزمن می شود.یعنی میکروب وارد ارگان ها مانند مغز استخوان می شود. در اینحالت معمولا” آنتی بادی بلوکان از کلاس IgGناقص و IgA
در سرم بیمار تشکیل می گردد.
تشخیص آزمایشگاهی
تشخیص بیماری بر اساس جدا نمودن باکتری از بیمار و کشت آن در محیط های مخصوص می باشد
ولی بدلیل طولانی بودن زمان کشت و پائین بودن حساسیت آن بیشتر از روشهای تشخیص سرولوژیک در تشخیص استفاده می شود.
روشهای سرولوژیک:
۱-تست آگلوتیناسیون
در تست های آگلوتیناسیون از سوسپانسیون کشت باکتری که توسط حرارت کشته شده است استفاده می شود.(۴) برای قابل رویت شدن واکنش از ذراتی مانند رنگ رزبنگال برای سوار نمودن ذرات میکروبی روی آن استفاده می شود. برای پایداری آنتی ژن و عدم رشد قارچ یا میکروب های موجود در محیط به آن فنل اضافه می نمایند. از این آنتی ژن فنله برای آزمون های رایت وکومبس رایت استفاده می شود.
۲-آزمون ثبوت مکمل
بر مبنای مصرف کمپلمان در اثر تشکیل کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی استوار است و کاربرد چندانی در آزمایشگاه ندارد .
۳-تست ELISA
حساسیت و ویژگی بسیار بالائی دارد.در این تست پدیده منطقه ای یا آنتی بادی های بلوکان دیده    نمی شود.در این روش با استفاده از آنتی بادی های آختصاصی می توان کلاس آنتی بادی موجود در سرم را نیز مشخص نمود.
۴-تست جلدی
با تزریق آنتی ژن بروسلا به صورت داخل جلدی انجام می شود. در بیماران یا افراد یا سابقه برخورد با آنتی ژن به صورت سرخی و سفتی در محل تزریق مشاهده می گردد. معمولا” قابل اعتماد نیست و تزریق آنتی ژن خود باعث افزایش تیتر آنتی بادی های سرم می شود.
نظر به استفاده وسیع از آزمون رایت در آزمایشگاه ها به شرح تقریبا” کامل آزمون رایت (ابته در حد توان) می پردازیم.
آزمون رایت
آزمون رایت بر اساس آگلوتیناسیون مستقیم است و برای مشخص نمودن کلاس آنتی بادی از مواد احیاء کننده مانند ۲-Mercaptoethanol (2ME) و یا Dithiotheiol (DTT) استفاده نمود.
آزمون رایت به دو روش سریع یا اسلایدی و روش بطئی یا لوله ای انجام می شود.
آزمون رایت به روش سریع یا اسلایدی
۱-ابتدا با یک پیپت ۰٫۱ میلی لیتری بر روی یک اسلاید مناسب به ترتیب مقادیر ۰٫۰۸
۰٫۰۴,  ۰٫۰۲,  ۰٫۰۱,   ۰٫۰۰۵,میلی لیتر از سرم بیمار را می ریزیم .
۲-از یک نمونه سرم مثبت و یک نمونه سرم منفی برای کنترول آگلوتیناسیون استفاده می کنیم .
۳-شیشه حاوی آنتی ژن را قبل از آزمایش از یخچال خارج نموده به حرارت آزمایشگاه می رسانیم .
به تمام سرم ها و سرم های مثبت و منفی یک قطره (در حدود ۰٫۰۳  میلی لیتر ) آنتی ژن را که به خوبی مخلوط شده است اضافه می کنیم.
۴-تمام نمونه ها را با آنتی ژن به خوبی توسط اپلیکاتور مخلوط می کنیم .
۵-اسلاید را برروی روتاتور یا در دست به صورت دورانی به مدت ۳ دقیقه حرکت می دهیم .
۶-نتیجه آگلوتیناسیون هر رقت از سرم را در زیر نور غیر مستقیم چراغ و در بالای یک صفحه تیره
به صورت زیر یادداشت می نمائیم .
الف-آگلوتیناسیون ۱۰۰٪ به عنوان۴+
ب- آگلوتیناسیون  ۷۵٪  به عنوان۳+
ج- آگلوتیناسیون ۰ ۵٪  به عنوان ۲+
د- آگلوتیناسیون ۲۵٪  به عنوان ۱+
ه- آگلوتیناسیون کمتر از ۲۵٪  به عنوان +/-
و-در صورتی که هیچ آگلوتیناسیونی مشاهده نشود به عنوان منی گزارش می شود.
اگر چه روش سریع برای محاسبه عیار سرم بیمار روش دقیقی نیست ولی با آن می توان به صورت تقریبی تیتر را مشخص نمود. بالاترین رقتی از سرم که ۵۰٪ (۲+) ایجاد آگلو تیناسیوننماید تیتر سرم می باشد.
حجم سرم به طور تقریبی معادل تیترهای زیر است :
۱:۲۰                           ۰٫۰۸ml
۱:۴۰                           ۰٫۰۴ml
۱:۸۰                           ۰٫۰۲ml
۱:۱۶۰                         ۰٫۰۱ml
۱:۳۲۰                       ۰٫۰۰۵ml
روش اسلاید به عنوان روش بیماریابی روش بسیار مناسب است که در صورت مثبت شدن حتما” باید
تیتر دقیق سرم توسط روش لوله ای تعیین گردد. البته از این روش نمی توان برای مشخص کردن کلاس آنتی بادی و یا آنتی بادی بلوکان استفاده نمود.
در مواردی که تیتریا عیار آنتی بادی در سرم بسیار بالا باشد بدلیل پدیده منطفه ای یا پروزون تیترهای مورد استفاده در روش اسلاید ممکن است منفی شوند. که جزء نفاط ضعف روش اسلاید میباشد.
در یکسری ازتجارب دوستان مشخص شده است که چنانچه تیترهای روش اسلایدی را علاوه بر
مشاهده ماکروسکوپی در زیر میکروسکوپ نیز بررسی شود.وجود تجمع های آنتی ژنی در زیر میکروسکوپ می تواند نشانه ای از پدیده منطقه ای باشد.
نکته مهم در روش اسلاید قرائت نتایج در مدت ۳ دقیقه می باشد.در اثر ماندن نمونه آب خود را از دست داده و باعث چسبیدن آنتی ژن ها به هم شده و بطور کاذب آزمون را مثبت می کند.
آزمون رایت به روش لوله ای یا بطئی
۱-۱۱ لوله آزمایش را در جا لوله ای قرار دهید
۲-در لوله اول ۰٫۹ میلی لیتر وبه لوله های بعدی ۰٫۵ میلی لیتر سرم فیزیو لوژی بریزید.
۳-به لوله اول ۰٫۱ میلی لیتر سرم اضافه کرده خوب مخلوط کنید و ۰٫۵ سی سی از لوله اول را به لوله دوم وهمینطور تا لوله دهم رقت متوالی تهیه میکنیم واز لوله دهم ۰٫۵ سی سی را دور میریزیم
۴- لوله یازدهم به عنوان کنترول آنتی ژن بوده و فاقد سرم است .
۵-برای سرم کنترول های مثبت و منفی هم عینا” همین کار را انجام میدهیم .
۶-به تمام لوله ها ۰٫۵ سی سی آنتی ژن بروسلا لوله ای اضافه میکنیم .( در صورت لزوم آن را طبق دستور سازنده با سرم فیزیولوژی  رقیق یا به صورت غلیظ  استفاده کنید )
۷- لوله ها را مخلوط کرده ودر بن ماری ۳۷ درجه  بمدت ۴۸ ساعت نگهداری نموده وسپس نتایج را  به صورت ذیل قرائت میکنیم.
ابتدا لوله های شاهد آنتی ژن و کنترول سرم وسپس لوله های بیماران رادر بالای یک صفحه تیره و نور غیر مستقیم چراغ مورد بررسی قرار می دهیم .
الف-چنانکه تمام آنتی ژن آگلوتینه شود ومایع رویی شفاف باشد جواب را بصورت ۴+ یادداشت کنید
ب-اگر ۷۵٪ آنتی ژن آگلوتینه شودومایع رویی نسبتا کدرباشد جواب را بصورت ۳+ یادداشت کنید
ج- اگر ۵۰٪ آنتی ژن آگلوتینه شودومایع رویی نسبتا کدرباشد جواب را بصورت ۲+ یادداشت کنید
د- اگر ۲۵٪ آنتی ژن آگلوتینه شودومایع رویی کدرباشد جواب را بصورت ۱+ یادداشت کنید
ه-اگر رسوبی دیده نشود ومانند لوله شاهد آنتی ژن کدر باشد منفی گزارش می شود.
تیتر نهایی رقتی از سرم است که حداقل جواب ۲+ داده باشد.
آزمون کومبس – رایت
۱-ابتدا آزمایش رایت لوله ای را انجام می دهیم
۲-لوله ها را سانتریفوژ کرده ومایع رویی را دور ریخته و رسوب را سه بار  با سرم فیزیولوژی بشوئید.
۳-به هر لوله یک قطره آنتی گلبولین انسانی (سرم کومبس)اضافه کنید.
۴-لوله ها را یک ساعت در بن ماری ۳۷ درجه قرار دهید.
۵- به لوله ها آنقدر سرم فیزیولوژی بریزید تا حجم نهائی لوله ها به یک سی سی برسد.
۶-لوله ها را تا روز بعد در ۳۷ درجه قرار دهید.
۷-لوله ها را مانند دستور رایت قرائت کنید.
تشخیص کلاس آنتی بادی ضد بروسلا یا آزمایش ۲ME –Wright test
این آزمایش بدنبال مثبت شدن آزمایش رایت انجام می شود.مهمترین کاربرد آن افتراق بین بروسلوز فعال از غیر فعال در فردی که علایم بالینی بیماری را دارد ولی کشت خون او استریل است و تیتر آزمایش رایت او نیز پائین است .بعلاوه با انجام این آزمایش می توان تاثیر آنتی بیوتیک مناسب را در درمان بیماری تحت بررسی قرار داد.
محلول های لازم :
۱-محلول۲ME)-Mercaptoethanol) ویا  Dithiotheiol (DTT)
۲-آنتی ژن بروسلا.
لازم به تذکر است آنتی ژن سرم وسایر محلول هایی که استفاده می شود فافد فنل باشد زیرا فنل مانع از عملکرد مواد ایاء کننده می شود.در صورتی که آنتی ژن فنله باشد باید قبل از آزمایش چند بار آنرا با بافر فسفات نمکی شستشو داد .
روش کار
۱-تعدادی از لوله های آزمایش را در جا لوله ای قرار دهید
۲-مقدار ۰٫۵ سی سی از محلول احیاء کننده (۲ME یا DTT ) را در لوله اول بریزید .
۳- مقدار ۰٫۵ سی سی از سرم بیمار را به لوله اول اضافه کنید.
۴-لوله اول را یک ساعت در دمی اتاق فرار دهید تا مواد احیاء کننده باعث غیر فعال شدن IgM
گردد.
۵-به سایر لوله ها ۰٫۵ سی سی از محلول احیاء کننده اضافه کنید.
۶-پس از یک ساعت مقدار ۰٫۵ سی سی از لوله اول برداشته وبه لوله دوم منتقل کرده و همینطور تا آخرین لوله رقت متوالی تهیه میکنیم.از لوله دهم ۰٫۵ سی سی را دور بریزید.
۷-به تمام لوله ها ۰٫۵ سی سی آنتی ژن بروسلا فاقد فنل اضافه کنید.
۸-لوله ها را۴۸ ساعت در ۳۷ درجه انکوبه کنید و سپس مانند روش رایت لوله ای قرائت نمائید
روش انجام رایت سانتریفوژ
در این روش سرم را طبق روش رایت معمولی سرم را اقیق کرده وبه آنها آنتی ژن بروسلا اضافه میکنیمو بلافاصله با سرعت ۲۵۰۰ دور در دقیقه بمدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ کرده و قرائت می کنیم
در این روش علاوه بر افزایش سرعت عمل اکثرا” پدیده منطقه ای نیز از بین می رود.این روش جایگزین مناسبی برای روش سنتی رایت است و به خوبی از آن میتوان در انجام تست کومبس رایت
نیز استفاده نمود.
توصیه میگردد که دور سانتریفوژ حتما” بررسی شود تا خیلی زیاد یا کم نباشدو ایجاد مثبت کاذب یا منفی کاذب ننماید.البته برای قرائت نتایج در روش های کلاسیک انجام آزمون های رایت نیز  سانتریفوژ کردن لوله ها توصیه می گردد.
تفسیر نتایج آزمایشات سرو لوژیک تب مالت
سرم افراد طبیعی به نسبت ۱:۱۰ و بندرت ۱:۲۰ آنتی ژن بروسلا ملی تنسیس را آگلوتینه می نماید .
تیتر سرم افراد نرمال درمناطق مختلف ایران متفاوت میباشد مثلا” در مناطقی که دامداری رواج دارد
تیتر سرم افراد ممکن است تا ۱:۱۶۰ هم برسد ولی بیماری وجود نداشته باشد.
مانند تمام روش های سرولوژیک افزایش تیتر آنتی بادی در سرم فرد دارای ارزش زیادی می باشد.
ولی چنانچه تیتر سرم ثابت باشد (مثلا”۱:۸۰ ) بیمار مبتلا نمی باشد.
بطور کلی وقتی تیتر آنتی بادی بالا باشد می توان گفت بیمار مبتلا  به بروسلوز است و بیماری در حال پیشرفت است .در بعضی از حالات در کودکان کشت خون مثبت میشود و بیمار مبتلا به بروسلوز است ولی تا مدت مدیدی به علت وضعیت خاص سیستم ایمنی تست رایت منفی است و یا تا
مدت ها ۱:۲۰ تا ۱:۴۰ مثبت باقی می ماند. بنابراین وقتی تست رایت منفی باشد نمی توان بطور قاطع بروسلوز را رد نمود.کسانی که شیر بز مصرف می کنند تیتر سرم آنها ممکن است به ۱:۲۰ تا
۱:۴۰ مثبت می شود .اشخاصی که واکسن وبا دریافت کرده اند تست رایت ممکن است ۱:۸۰ مثبت باشد

پاسخ دهید