معماری
آزمایش 2me

آزمایش 2me مركاپتواتانول

آزمايش2- مركاپتواتانول: 2-Mercaptoethanol(2ME)Brucella Agglutination Test

تستهاي معمول آگلوتيناسیون براي تشخيص بروسلوز تنها وجوديا عدم آگلوتينين هاي ضد آنتي ژن بروسلا را در سرم بيمار مشخص مي نمايد. بدون آن كه قادر به افتراق نوع آگلو تينين هاي موجود يعنيIgM از IgG باشند . آزمايش 2ME براي تعيين ماهيت ايمونوگلوبولين موجود در سرمي كه سبب اگلوتيناسيون مي شود انجام ميگيرد . 2- مركاپتواتانول ماده احياء كننده ايست كه درغلظت معين باندهاي دي سولفيد (disulphide bond ) IgM را شكسته وباعث از بين رفتن خاصيت آگلو تيناسيون IgM مي شود . اگر سرم بيمار قدرت آگلوتيناسيون خود را پس از مجاورت با 2ME از دست بدهد نشاندهنده اينست كه آگلوتينين موجود IgM بوده است ولي اگر قدرت آگلوتيناسيون سرم پس از تاثير 2ME باقي بماند دليل بر وجود آگلوتينين IgG و تيتر بدست آمده همان تيتر IgG ميباشد . آزمايش 2ME به همان روش آگلوتيناسيون لوله اي رايت (Wright) انجام مي گيرد با اين تفاوت كه رقتهاي سرم ، در سرم فيزیولوژي حاوي 2ME تهيه مي گردد. مي توان بجاي 2ME از ماده ديگري بنام Dithiothrietol( محلولي با غلظت 005/0 مولكول گرم ) استفاده كرد .

ضمنا به سبب قابليت اكسيد شدن بيش از حد 2MEدر رقتهاي بالا اعتقاد بر اين است كه بايد از بافر تازه تهيه شده 2MEبراي تعيين طبيعت آنتي بادي موجود در سرم بيمار استفاده گرددو پيشنهاد مي نمايد كه براي اين هدف بهتر است ماده احياء كننده را تازه و روزانه و با سرم مورد آزمايش مخلوط نموده و سپس آزمون آگلوتيناسيون را ا نجام داد .

روش انجام آزمايش :

مواد مورد لزوم :

  • محلول غليظ2- مركاپتو اتانول
  • لوله هموليز
  • آنتي ژن لوله اي انستيتو پاستوريا انستيتو رازي كه اتو آگلو تيناسيون نداشته و يكنواخت و هموژن باشد .

-A ابتدا محلول 2/0 ملكول گرم در ليتر 2ME در آب مقطر تهيه مي كنيم (68/0 ميلي ليتر مركاپتو اتانول در 0 5 ميلي ليتر آب مقطر)

سپس به تعداد نمونه هاي سرم مورد آزمايش لوله هموليز در نظر گرفته ودر هر لوله 3/0 ملي ليتر سرم فيزیولوژي + 2/0 ميلي ليتر سرم بيمار + 5/0 ميلي ليتر محلول مركاپتو اتانول مي ريزيم .

-B لوله را بمدت يكساعت در اتو 37 درجه قرار ميدهيم تا مركاپتو اتانول بر روي IgM اثر نمايد.

-C لوله هارا از اتو خارج ساخته و براي هر نمونه سرم به مانند سرو آگلوتيناسيون در لوله تعداد مورد نياز لوله هموليز در نظر مي گيريم و رقتهاي سريال (serial dilution) تهيه مي كنيم بدين ترتيب كه به استثنا لوله اول ( كه لوله حاوي سرم و مركاپتواتانول مي باشد ) در تمام لوله ها 5/0 ميلي ليتر سرم فيزیولوژي مي ريزيم سپس از محتوي لوله اول 5/0 ميلي ليتر به لوله دوم مي ريزيم و پس از مخلوط كردن از لوله دوم 5/0 ميلي ليتر به لوله سوم انتقال مي دهيم. اين عمل را تا لوله ما قبل آخر ادامه مي دهيم و از اين لوله5/0 ميلي ليتر دور ريخته مي شود. ( لوله آخر به عنوان كنترل است كه فقط حاوي سرم فيزیولوژي وآنتي ژن خواهد بود )رقت هاي نهايي از 1:10تا 1:5120 خواهد بود .

-D به هر لوله مقدار 5/0 ميلي ليتر از همان آنتي ژن سرو آگلو تيناسيون لوله اي مي ريزيم (يا آنتي ژن مخصوص 2ME ساخت انستیتو پاستور)

-E لوله هارا به مدت 24-20 ساعت در اتو 37 درجه قرار مي دهيم و سپس لوله هارا از نظر وجود آگلو تيناسيون بررسي مي كنيم.

پس از تاثير 2ME بر روي سرم آگلوتينين هاي با ماهيت IgM حذف می شوند و چون آگلوتيناسيون مورد مشاهده تنها ناشي از وجود IgG است لذا تيتر IgG موجود در سرم را نشان مي دهد . ضمنا توصيه مي شود كه محلول رقيق شده 2ME در روز مصرف تهيه شود و تامپون مصرفي بدون فنل مورد استفاده قرار گيرد .

بطور معمول تيتر قبل از درمان 1:40 به بالا در آزمايش2- مركاپتو اتانول مثبت تلقي شده ضمن آنكه هر تيتري در اين آزمايش و بويژه تيتر 1:20 مي تواند نشانه اي از آلودگي بوده مگر اين كه خلاف آن ثابت شود .