معماری

بررسی آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم

اگلوتیناسیون اسپرم‌ها می‌تواند نشانه وجود آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم باشد. البته آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم همیشه باعث اگلوتیناسیون نمی‌شوند، از طرفی اگلوتیناسیون اسپرم‌ها نیز ممکن است به دلایل دیگری ایجاد شود. وجود آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم به‌تنهایی، دلیلی کافی برای تشخیص وجود بیماری خودایمنی اسپرم نیست و باید ثابت شود که این آنتی‌بادی‌ها در عملکرد اسپرم اختلال شدید ایجاد کرده‌اند. برای بررسی این امر، از آزمایش Sperm-mucin-penetration استفاده می‌شود (بخش 3-3). آنتی‌باد‌ی‌های ضد اسپرم در اتصال اسپرم به ناحیه زوناپلوسیدا و فعالیت اکروزوم نیز اختلال ایجاد می‌کنند
آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم عمدتاً به دو گروه IgA و IgG تعلق دارند. آنتی‌بادی‌هایIgM به‌ندرت در مایع منی دیده می‌شوند.

از نظر بالینی، آنتی‌بادی‌های IgA مهم‌تر از IgG هستند. هر دو آنتی‌بادی را می‌توان بر روی اسپرماتوزوئیدها و یا در مایعات بدن شناسایی نمود.
الف- جستجوی آنتی‌بادی‌های موجود بر روی اسپرم‌ها (آزمایشات مستقیم):
در این بخش به شرح دو آزمایش می‌پردازیم:
a) Mixed antiglobulin reaction test (MAR)
b) Immunobead test (IB)
تست MAR بر روی نمونه تازه اسپرم انجام می‌شود در حالیکه IB بر روی اسپرم‌های شسته شده انجام می‌گیرد. نتایج این دو روش همیشه بر هم منطبق نیست.
ب) جستجوی آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم در مایعات بدن (روش‌های غیرمستقیم): در این روش، آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم (ASA) را در مایعاتی از قبیل پلاسمای منی، سرم خون یا موکوس سرویکال جستجو می‌کنیم. اسپرم‌های شسته شده نرمال و عاری از آنتی‌بادی را با مایعات فوق مجاور می‌کنیم؛ در صورتی که ASA وجود داشته باشد به اسپرم‌ها چسبیده و این اسپرم‌ها را بعداً به روش‌های مستقیم بررسی می‌کنیم.
نکته یک: در روش‌های مستقیمی که برای شناسایی ASA به کار گرفته می‌شوند، اسپرم‌ها باید دارای تحرک باشند. اگر اسپرم‌های متحرک به تعداد کافی وجود نداشته باشند باید از تست‌های غیرمستقیم استفاده کرد.
نکته دو: آنتی‌بادی‌های سیتوتوکسیک که باعث مرگ یا بی‌حرکت شدن اسپرم‌ها می‌شوند با این روش‌ها قابل شناسایی نیستند.
 واکنش آنتی‌گلبولین مخلوط(MAR):
این تست، سریع و حساس است اما نسبت به ایمونوبید از دقت کمتری برخوردار است. در این تست، ذرات لاتکس یا گلبول‌های قرمز پوشیده از IgA یا IgG را با مایع منی مجاور می‌کنند. سپس یک آنتی‌سرم IgA یا IgG به سوسپانسیون می‌افزایند. اگر اسپرم‌ها با آنتی‌بادی پوشیده شده باشند، یک آگلوتینه اسپرم- لاتکس ایجاد می‌شود زیرا آنتی‌سرم مثل یک پل عمل می‌کند؛ از طرفی به اسپرم‌ها و از سوی دیگر به ذرات لاتکس می‌چسبد و ایجاد یک توده اگلوتینه می‌کند.
 روش کار:
الف- مایع منی را به خوبی مخلوط کنید.
ب- مقدار Lµ 5/3 از آن را برداشته و بر روی یک لام میکروسکوپ قرار دهید. Lµ5/3 دیگر را هم در قسمت دیگری از لام قرار دهید.
ج- بر روی یک لام دیگر Lµ5/3 از مایع منی ASA مثبت و ASA منفی را به عنوان کنترل قرار می‌دهیم. برای تهیه کنترل مثبت می‌توان اسپرم‌های طبیعی را با سرم فردی که دارای ASA می‌باشد انکوبه کرد.
د- Lµ 5/3 از ذرات لاتکس پوشیده از IgG را به نمونه‌های بیمار و کنترل‌های مثبت و منفی افزوده و مخلوط می‌کنیم.
ه- Lµ5/3 آنتی‌سرم ضد IgG به سوسپانسیون فوق افزوده و مخلوط می‌کنیم.
و- سوسپانسیون‌ها را با لامل 22×22 پوشانده تا عمقی حدود Lµ20 ایجاد شود.
ز- لام‌ها را 3 دقیقه به طور افقی در یک محیط مرطوب قرار داده تا خشک نشوند، برای این کار می‌توان از یک ظرف پتری استفاده نمود و یک کاغذ صافی مرطوب در آن قرار داد.
ح- لام‌ها را با میکروسکوپ فازکنتراست و بزرگنمایی 200 یا 400 پس از 3 دقیقه و 10 دقیقه بررسی می‌کنیم.
ط- آزمایش را با ذرات پوشیده ازIgA و آنتی‌سرم ضد IgA نیز انجام دهید.
ارزیابی نتایج:
در صورتی که آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم سطح اسپرم‌ها را پوشانده باشند به کمک آنتی‌سرم به ذرات لاتکس می‌چسبند. دراین حالت اسپرم‌های متحرک با ذرات لاتکس حرکت می‌کنند و در نهایت اگلوتیناسیون آنقدر زیاد می‌شود که حرکت اسپرم محدود می‌گردد. اسپرم‌های فاقد آنتی‌بادی، آزادانه در بین ذرات لاتکس حرکت می‌کنند لذا حرکت ذرات لاتکس با اسپرم‌های ‌متحرک به عنوان نتیجه مثبت تلقی می‌شود. یکی از مشکلات این روش وجود اسپرم‌های بی‌حرکت در مجاورت ذرات لاتکس است که ممکن است باعث اشتباه در تشخیص شوند. در این حالت اگر با نوک سمپلر به آرامی روی لامل بزنیم مشاهده می‌کنیم که ذرات لاتکس آزادانه حرکت می‌کنند و به اسپرم‌ها نچسبیده‌اند.
برای ارزیابی نتایج ،200 اسپرم متحرک را در نظر گرفته و درصد اسپرم‌هایی که دو یا چند ذره لاتکس به آنها چسبیده و در حرکت هستند را حساب کنید. کلاس آنتی‌بادی IgG) یا IgA) و محل چسبیدن ذرات لاتکس به اسپرم (سر، قطعه میانی یا قطعه اصلی) را نیز تعیین نمایید. اگر ذرات لاتکس فقط به نوک دُم اسپرم‌ها چسبیده باشند به عنوان نتیجه مثبت در نظر گرفته نمی‌شوند.
نکته یک: اگر 100% اسپرم‌ها طی 3 دقیقه اول به ذرات لاتکس چسبیدند جواب مثبت است. در این حالت نیاز نیست که نتایج بعد از 10 دقیقه نیز بررسی شوند.
نکته دو: اگر کمتر از 100% اسپرم‌ها طی 3 دقیقه اول به ذرات لاتکس چسبیدند نتایج را مجدداً پس از 10 دقیقه نیز بررسی کنید.
نکته سه: اگر اسپرم‌ها با گذشت 10 دقیقه بی‌حرکت شدند، همان نتایج دقیقه سوم را به عنوان جواب آزمایش در نظر بگیرید.
 مقادیر مرجع:
در این کتاب حد مرجع عبارت است از زمانی که 50% از اسپرم‌های متحرک به ذرات لاتکس چسبیده باشند. در بدن انسان اگر 50% اسپرم‌ها (یا بیشتر) دارای آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم باشند، عمل ورود اسپرم به موکوس سرویکال و بارورسازی تخمک مختل خواهد شد.
 آزمایش ایمونوبید مستقیم (IB):
این آزمایش اگرچه وقت‌گیرتر از MAR است اما دقت بیشتری نسبت به آن دارد. در IB مستقیم، ذرات پوشیده از آنتی IgG یا آنتی IgA را با اسپرم‌های شسته شده مجاور می‌کنند. (شستن اسپرم باعث می‌شود تأثیر عوامل استتارکننده موجود در مایع منی خنثی شود. این عوامل بر روی آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم نشسته و آنها را استتار می‌کنند و در نتیجه آزمایش به طور کاذب منفی می‌شود) .اتصال ذرات لاتکس به اسپرم‌های متحرک نشانه آن است که آنتی‌بادی‌هایIgA یا IgG بر سطح اسپرم وجود دارند.
مواد موردنیاز:
الف- محلول سالین گلوکز- فسفات بافردولبکو (PB5) با سرم آلبومین گاوی (BSA) یا محلولTyrode,s (طرز تهیه این محلول‌ها در ضمیمه 2-4 و 9-4 خواهد آمد)
ب- بافر شماره І: مقدار 3/0 گرم از Cohn Fraction V BSA را به ml100 از PBS دولبکو یا Tyrode اضافه کنید.
ج- بافر شماره Π: مقدار 5 گرم از Cohn Fraction V BSA را به ml 100 از PBS دولبکو یا Tyrode اضافه کنید.
د- محلول‌های فوق را با استفاده از کاغذ صافیm µ 45/0 صاف نموده و قبل از مصرف به دمایc º35-25 برسانید.
 طرز تهیه ایمونوبید:
الف- برای هر یک از انواع آنتی‌بادی (IgG وIgA) مقدار ml2/0 از سوسپانسیون ذخیره ذرات لاتکس را به ml 10 از بافرІ اضافه کنید (در لوله سانتریفوژ)
ب- لوله‌ها را در g500 یا g600 به مدت 10- 5 دقیقه سانتریفوژ کنید.
ج- محلول رویی را خالی نمایید.
د- به ذرات رسوب کرده در ته لوله، ml2/0 از بافر Π اضافه کنید.
 آماده‌سازی اسپرم‌ها:
مقدار اسپرم مورد نیاز برای این آزمایش بستگی به غلظت و حرکت اسپرم داشته

الف- مایع منی را به خوبی مخلوط کنید.
ب- مقدار موردنیاز از مایع منی را به لوله سانتریفوژ منتقل نموده و حجم آن را با بافر І به ml10 برسانید.
ج- در دور g500 به مدت 10- 5 دقیقه سانتریفوژ کنید.
د-محلول رویی را خالی کنید.
ه- با ملایمت رسوب اسپرم را در ml10 بافر І تازه، سوسپانسیه نمایید.
و- مجدداً در g500 به مدت 10- 5 دقیقه سانتریفوژ کنید.
ز- محلول رویی را خالی نمایید.
ح- رسوب اسپرم را به آرامی در ml2/0 بافر Π حل کنید.
نکته یک: اگر بیش از ml1 مایع منی برای آزمایش استفاده شود، باید سه بار آن را شستشو داد.
نکته دو: اگر حرکت اسپرم‌ها در نمونه 10% یا کمتر باشد، ممکن است نتایج صحیحی به‌دست نیاید. در این موارد از تست ایمونوبید غیرمستقیم استفاده کنید.

 

روش کار:
برای هر نمونه، بایداز اسپرم‌های ASA مثبت و ASA منفی به عنوان کنترل استفاده نمود.
الف- Lµ5 از سوسپانسیون اسپرم‌های شسته را روی یک لام قرار دهید.
ب- Lµ5 کنترل مثبت و منفی را در روی لام دیگری قرار دهید.
ج- Lµ5 از سوسپانسیون ایمونوبید- آنتی IgG به هر یک از نمونه‌های بیمار، کنترل مثبت و کنترل منفی افزوده و با نوک سمپلر آنها را مخلوط کنید.
د- یک لامل 22×22 روی آنها قرار داده تا عمقی حدود mµ20 ایجاد شود.
ه- لام‌ها را 10-3 دقیقه به طور افقی در حرارت اتاق و محیط مرطوب قرار دهید (مثلاً داخل یک ظرف پتری حاوی کاغذ صافی مرطوب). توجه داشته باشید که این زمان نباید از 10 دقیقه بیشتر شود زیرا اتصال ذرات ایمونوبید پس از 10 دقیقه کاهش می‌یابد.
و- لام‌ها را با بزرگنمایی 200 یا 400 و میکروسکوپ فازکنتراست بررسی کنید.
ز- اسپرم‌های متحرکی که یک یا چند ذره لاتکس به آنها چسبیده است را ارزیابی نمایید.
ح- نتایج را مطابق آنچه در بخش 3-1-20-2 بیان شد، گزارش کنید.
ط- این آزمایش را با ذرات پوشیده از IgA نیز انجام دهید.
 مقادیر مرجع:
اگر 50% یا بیشتر از اسپرم‌های متحرک (پیشرونده یا غیر پیشرونده) متصل به ذرات لاتکس باشند، تشخیص ناباروری ایمیون محرز است. اگر ذرات لاتکس فقط به نوک دم اسپرم‌ها چسبیده باشد به عنوان نتیجه مثبت تلقی نمی‌شود.
 آزمایش ایمونوبید غیرمستقیم:
این تست برای جستجوی آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم در مایعات عاری از اسپرم به‌کار می‌رود (مثل سرم، پلاسمای منی و موکوس سرویکال). اسپرم‌های فاقد آنتی‌بادی (که از افراد سالم گرفته می‌شوند)، آنتی‌بادی‌های موجود در مایعات فوق‌الذکر را جذب نموده و سپس به روش ایمونوبید مستقیم ارزیابی می‌شوند.
 معرف‌ها:
. اگر از موکوس سرویـکال استفـاده می‌شود باید آن را تحت اثر بروملین ml/Іu 10 قرار داد. بروملین یک آنزیم پروتئولیتیک است که باعث سیال شدن موکوس می‌شود.
 تهیه ایمونوبیدها:
.
 آماده‌سازی نمونه برای انجام آزمایش:
الف- اگر از موکوس سرویکال برای آزمایش استفاده می‌کنید آن را نسبت 1+1 با بروملین ml/Іu 10 مخلوط کرده و به مدت 10 دقیقه در c°37 قرار دهید. پس از آنکه نمونه سیال شد، آن را به مدت 10 دقیقه در g2000 سانتریفوژ کرده و سپس مایع رویی را برای آزمایش جدا کنید. در صورتی که آزمایش سریعاً انجام نشود باید نمونه را در °c70- منجمد نمود.
ب- نمونه‌های موکوس سرویکال سیال شده، سرم، پلاسمای منی را به مدت 45-30 دقیقه در °c56 قرار داده تا کمپلمان غیرفعال شود.
ج- نمونه‌های غیر فعال شده را به نسبت 4+1 با بافر شماره Π مخلوط کنید (مثلاً Lµ10 از مایع مورد آزمایش با Lµ40 بافر شماره 2)
د- در هر آزمایش از کنترل‌های مثبت و منفی نیز باید استفاده نمود. برای این کار می‌توان از سرم دارای آنتی‌بادی ضد اسپرم به عنوان کنترل مثبت و از سرم افراد سالم به عنوان کنترل منفی استفاده کرد.
انکوباسیون اسپرم‌ها با مایع مورد آزمایش:
الف- Lµ50 از سوسپانسیون اسپرم را با Lµ50 از مایع مورد آزمایش که قبلاً رقیق نموده‌ایم مخلوط نمایید.
ب- یک ساعت در c°37 انکوبه کنید.
ج- به مدت 10-5 دقیقه در g500 سانتریفوژ نمایید.
د- مایع رویی را خالی نموده و رسوب اسپرم‌ها را در ml10 از بافر شماره І (تازه تهیه شده) حل نمایید.
ه- در g500 به مدت 10-5 دقیقه سانتریفوژ کنید.
و- محلول رویی را خالی نموده و عمل شستشو را (مراحل 4 و5) تکرار نمایید.
ز- به آرامی رسوب اسپرم را در ml0.2 از بافر Π حل کنید.
 تست ایمونوبید:
مخلوط اسپرم با مایع مورد آزمایش را مثل بخش 4-2-20-2 آزمایش نموده و نتایج را مطابق آنچه در بخش‌های 2-1-20-2 و 3-1-20-2 ذکر شد ارزیابی و گزارش نمایید.

 

منبع:مجله خبری ازمایشگاه