معماری
HBS AG

آزمایش HBS AG هپاتیت B

روش انجام تست HBS Ag(هپاتیت B),آزمایش hbs ab,آزمایش hcv ab,آزمایش anti hcv,آزمایش hbs ag در بارداری,آزمایش hbc ab,hbsag مخفف چیست,میزان نرمال hbs ab,جواب آزمایش هپاتیت,آزمایش هپاتیت b

هپاتیت ویروسی مزمن ممکن است ناشی از عفونت با HBV یا HCV باشد. عفونت ممکن است منجر به یک حالت ناقل طولانی مدت و بیماری کبدی مزمن خفیف تا شدید شود. دو هفته پس از عفونت با هپاتیت B، می­توان مقدار زیادی از پروتئین ویروس (آنتی‏ژن سطحی ویروس) را در سرم و پس از آن پاسخ آنتی‏بادی به پروتئین‏های ویروس (anti-HBs) را ردیابی کرد. آنتی‏بادی­های ضد HBV در اکثریت بیماران برای تمام عمر پا بر جا می‏مانند. بهرحال حدود ۱۰% از عفونت‏های HBV منجر به یک حالت ناقل مزمن می‏شود که مشخصه آن فقدان anti-HBs  است ولی anti-HBc و معمولاً HBsAg  باقی می‏مانند.  تشخیص این گونه موارد باید با ردیابی  HBV DNA  در سرم یا بافت کبد تکمیل شود.

نام اختصاری:  HBV Quantitative Real-Time PCR

سایر نام ها: اندازه گیری کمی ویروس هپاتیت  Bبا روش Real-Time PCR،  Hepatitis B Quantitation، HBV DNA Quantitation،HBV DNA detection by Real time PCR  ، HBV viral Load

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: پلاسما، سرم، بافت کبد

حجم نمونه مورد نیاز:  ۵ ml

شرایط نمونه گیری:

  1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
  2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های حاوی EDTA صورت گیرد.
  2. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
  3. از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
  4. پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC 20 – نگهداری شود.
  5. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
  6. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
  7. برای تهیه پلاسما از مواد ضد انعقاد EDTA یا سدیم سیترات استفاده شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

  1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
  2. قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
  3. در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد.

شرایط نگهداری:

  1. پس از جدا سازی سرم یا پلاسما در شرایط استریل، باید تا زمان انجام  آزمایش، آن را در دمای ºC 20 – نگه دارید.  سرم باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری از لخته جدا شده و  به صورت منجمد نگهداری شود. بافت کبد نیز باید تا زمان انجام آزمایش های بعدی در oC 20 – نگهداری شود.
  2. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
  3. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در ۲۴ ساعت اولیه، نمونه را در oC 20 – فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

  1. تأیید عفونت مزمن ویروس هپاتیت B ( (HBV
  2. تعیین کمی HBV-DNA  سرم بیماران مبتلا به عفونت مزمن HBV (سابقاً HBsAg مثبت بوده اند.)
  3. نظارت بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV

اطلاعات تکمیلی:

روش مرجع: Blot DNA Hybridization Based – Slot

روش ارجح: DNA Detection and Quantification by Real-Time PCR

سایر روشها:  Qualitative DNA Detection Real-Time PCR، تکثیر DNA  با استفاده از روش PCR Conventional.

مقادیر طبیعی:  DNA ویروس  HBV در نمونه های سرم یا بافت کبدی افراد سالم وجود ندارد و ردیابی نمی شود.

محدوده قابل سنجش (مثبت): IU/ml  ۱۰۹ × ۲۵ – ۵

تفسیر:

کاوش پروبDNA ، یک اندازه‏گیری مستقیم HBV در سرم یا پلاسما را امکان­پذیر ساخته و با تیترهای آلایندگی (infectivity)  ارتباط دارد. اطلاعات حاصله از این آزمایش باید همراه با تست‏های سرولوژیک و  ردیابی HBsAg  مورد استفاده قرار گیرد HBV DNA حساس‏ترین مارکر برای عفونت جاری (ongoing) است. اندازه‏گیری کمی DNA ویروس ارزش پروگنوستیک داشته و از آن به عنوان پاسخی به درمان ضد ویروسی استفاده می‏شود. همزمان با پاک شدن عفونت از بدن، سطوح HBV DNA  و HBsAg افت می‏کند. در مراحل بعدی بیماری که آمینوترانسفرازها طبیعی می‏شوند، DNA  ویروس با تکنیک‏های هیبریداسیون منفی می‏شود ولی غالباً با PCR قابل ردیابی خواهد بود. ردیابی DNAنباید جای آزمایشات سرولوژیک را بگیرد.

عوامل مداخله گر :

  • هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
  • نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

توضیحات:

  • نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA ویروس هپاتیت (HBV) B در نمونه یافت نشده است.
  • نتایج کمی بیان شده به واحد IU/ml نشان دهنده میزان فعالیت ویروس HBV و تکثیر آن در بیمار است.
  • نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV نظارت می کند.
  • ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونت HBV باید با آزمایشات سرولوژیک HBV آغاز گردد. از جمله، آزمایش از نظر وجود آنتی ژن سطحی هپاتیت B مورد ارزیابی قرار گیرد.
  • تشخیص عفونت مزمن HBV صرفاً با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA  ویروس در نمونه سرم امکان پذیر نیست.
  • در صورت عدم وجود DNA ویروس در نمونه سرم بیمار و مثبت بودن Anti HBs، احتمال آلودگی به ویروس HBV رد نمی گردد.

روش انجام تست HBS Ag(هپاتیت B)

توضیحات و مراحل انجام تست به روش الایزا
توضیحات اولیه
ﻗﺒﻞ از ﺷﺮوع ﻣﺮاﺣﻞ آزﻣﺎﯾﺶ ﺗﻤﺎم ﻣﻮاد و ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎ را ﺑﻪ درﺟﻪ ﺣﺮارت اﺗﺎق رﺳﺎﻧﺪه و ﺑﺨﻮﺑﯽ ﺗﮑﺎن دﻫﯿﺪ ﺗﺎ ﮐﺎﻣﻼ ﯾﮑﻨﻮاﺧﺖ ﺷﻮﻧﺪ .
ﺑﻬﺘﺮ اﺳﺖ ﺑﻪ ﻣﺤﺾ ﺷﺮوع آزﻣﺎﯾﺶ ﮐﻠﯿﻪ ﻣﺮاﺣﻞ ﺑﺪون ﺗﻮﻗﻒ اﻧﺠﺎم ﭘﺬﯾﺮﻧﺪ .
از ﻧﻮک ﺳﻤﭙﻠﺮ ﯾﮏ ﺑﺎر ﻣﺼﺮف ﺑﺮای ﻫﺮ ﻧﻤﻮﻧﻪ اﺳﺘﻔﺎده ﮐﻨﯿﺪ .
ﭘﺲ از اﻓﺰودن ﻣﺤﻠﻮل ﻣﺘﻮﻗﻒ ﮐﻨﻨﺪه ، ﺟﺬب ﻧﻮری ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ ﺣﺪاﮐﺜﺮ ﺗﺎ ﻧﯿﻢ ﺳﺎﻋﺖ ﻗﺎﺑﻞ ﻗﺮاﺋﺖ ﻣﯽباشد.
برای ﮐﺴﺐ ﻧﺘﺎﯾﺞ ﻣﻄﻠﻮب ﺑﺎﯾﺪ ﺷﺴﺘﺸﻮی ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ ﺑﺼﻮرت ﮐﺎﻣﻞ ﺻﻮرت ﮔﺮﻓﺘﻪ و آﺧﺮﯾﻦ ﻗﻄﺮات ﭘﺲ از ﺷﺴﺘﺸﻮ از ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ ﺗﺨﻠﯿﻪ ﺷﻮد

از ﻣﻬﻤﺘﺮﯾﻦ ﻓﺎﮐﺘﻮرﻫﺎ در ﺣﺼﻮل ﻧﺘﯿﺠﻪ ﻣﻄﻠﻮب زﻣﺎن اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن ﻣﻨﺎﺳﺐ ﻣﯽ ﺑﺎﺷﺪ ، ﺑﻨﺎﺑﺮاﯾﻦ ﭘﯿﺸﻨﻬﺎد ﻣﯽ ﮔﺮدد ﻗﺒﻞ از ﺷﺮوع آزﻣﺎﯾﺶ ﺗﻤﺎم ﻣﻮاد و محلولهای ﻣﻮرد ﻧﯿﺎز را آﻣﺎده ﻧﻤﻮده و درب ﻣﺤﻠﻮﻟﻬﺎی ﻣﻮرد ﻧﯿﺎز را ﺑﺎز ﮐﻨﯿﺪ ، اﯾﻦ ﻋﻤﻞ ﺑﺎ ﮐﺎﻫﺶ ﻓﺎﺻﻠﻪ زﻣﺎﻧﯽ ﺑﯿﻦ ﻣﺮاﺣﻞ ﺳﻤﭙﻠﯿﻨﮓ ﺑﺎﻋﺚ ﻧﺘﺎﯾﺞ دﻗﯿﻘﺘﺮ ﻣﯽ ﺷﻮد .

ﻣﺮاﺣﻞ عملی اﻧﺠﺎم آزﻣﺎﯾﺶ :
ﺗﻌﺪاد ﭼﺎﻫﮑﻬﺎی ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ را اﻧﺘﺨﺎب ﻧﻤﻮده و ﺳﺎﯾﺮ ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را ﺑﻪ ﻫﻤﺮاه ﻧﻤﮕﯿﺮ درون ﮐﯿﺴﻪ ﻣﺨﺼﻮص ﻧﮕﻬﺪاری ﭘﻠﯿﺖ ﻗﺮار داده و درب آن را ﺑﺒﻨﺪﯾﺪ .
ابتدا ۲۰۰  لاندا از سرم  ﮐﻨﺘﺮل  مثبت /سپس ۲۰۰ لاندا کنترل منفی را درون چاهک ها بریزید…
از ستون ۱ و از A تا  G میکرو پلیت شروع کنید.
در ادامه ی کنترل ها ۱۰۰ لاندا از هر نمونه مریض را درون چاهک ها بریزید
به هر یک از  چاهک ها ۲۵ لاندا محلول کونژوگه اضافه کنید تا رنگ محلول داخل چاهک ها صورتی شود
درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت ۱۵ ثانیه به ملایمت تکان دهید .سپس به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور۳۷ درجه انکوبه نمایید.
ﺑﺪون ﺷﺴﺘﺸﻮی ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ ۲۵ لاندا از ﻣﺤﻠﻮل آﻧﺰﯾﻢ ﮐﻮﻧﮋوﮔﻪ ی ۲ را داﺧﻞ ﮐﻠﯿﻪ ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ بریزید. درب ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را ﺑﺎ ﺑﺮﭼﺴﺐ ﻣﺨﺼﻮص ﭘﻠﯿﺖ ﭘﻮﺷﺎﻧﺪه و ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را ﺑﻪ ﻣﺪت ۱۵ ﺛﺎﻧﯿﻪ ﺑﻪ ﻣﻼﯾﻤﺖ ﺗﮑﺎن دﻫﯿﺪ . ﺑﺎ اﻓﺰودن ﮐﻨﮋوﮔﻪ ۲ رﻧﮓ ﮐﻨﺘﺮل ﻣﻨﻔﯽ از زرد ﺑﻪ ﺳﺒﺰ و رﻧﮓ ﮐﻨﺘﺮل ﻣﺜﺒﺖ و ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎ ﺑﻨﻔﺶ ﻣﯽ ﺷﻮﻧﺪ .

ﭘﺲ از ﭘﻮﺷﺎﻧﺪن ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ ﺗﻮﺳﻂ ﺑﺮ ﭼﺴﺐ ﻣﺨﺼﻮص ﭘﻠﯿﺖ ، ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را ﺑﻪ ﻣﺪت ۳۰ دﻗﯿﻘﻪ در۳۷ درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯽ ﮔﺮاد اﻧﮑﻮﺑﻪ ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ .

ﻣﺤﺘﻮﯾﺎت ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را ﺧﺎﻟﯽ ﮐﺮده و ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را ۵ ﺑﺎر ﺑﺎ ﻣﺤﻠﻮل ﺷﺴﺘﺸﻮی آﻣﺎده ﻣﺼﺮف ﺑﺸﻮﯾﯿﺪ . ﺑﺮای ﺷﺴﺘﺸﻮ ﭼﻨﺎﻧﭽﻪ دﺳﺘﮕﺎه ﺷﺴﺘﺸﻮی اﺗﻮﻣﺎﺗﯿﮏ در دﺳﺘﺮس ﻧﺒﺎﺷﺪ ﻣﯽ ﺗﻮان از ﺳﻤﭙﻠﺮ ۸ ﮐﺎﻧﺎﻟﻪ اﺳﺘﻔﺎده ﻧﻤﻮد وﻟﯽ ﺑﺎﯾﺪ ﻣﻮاﻇﺐ ﺑﻮد ﮐﻪ ﻣﺤﻠﻮل ﺷﺴﺘﺸﻮ از ﯾﮏ ﭼﺎﻫﮏ ﺑﻪ ﭼﺎﻫﮏ دﯾﮕﺮ وارد ﻧﺸﻮد زﯾﺮا ﻣﯽ ﺗﻮاﻧﺪ ﻣﻮﺟﺐ اﯾﺠﺎد ﺧﻄﺎ در ﻧﺘﯿﺠﻪ آزﻣﺎﯾﺶ ﮔﺮدد . در ﻫﺮ دﻓﻌﻪ ﺷﺴﺘﺸﻮ ﺣﺪود ۳۰۰ لاندا ﻣﺤﻠﻮل ﺷﺴﺘﺸﻮ در ﻫﺮ ﭼﺎﻫﮏ رﯾﺨﺘﻪ ، ﺳﭙﺲ ۱۵ ﺛﺎﻧﯿﻪ ﺻﺒﺮ ﮐﺮده و ﺑﻌﺪ ﭼﺎﻫﮏ ﻫﺎ را ﺑﺎ واروﻧﻪ ﮐﺮدن و ﺗﮑﺎﻧﺪن ﺧﺎﻟﯽ ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ و در اﻧﺘﻬﺎی ﻋﻤﻠﯿﺎت ﺷﺴﺘﺸﻮ ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را در ﺣﺎﻟﺖ واروﻧﻪ و ﺑﺎ ﺿﺮﺑﺎت ﻣﻼﯾﻢ ﺑﺮ روی ﯾﮏ ﭘﺎرﭼﻪ ﯾﺎ ﮐﺎﻏﺬ ﻧﻤﮕﯿﺮ ﺑﮑﻮﺑﯿﺪ ﺗﺎ ﻗﻄﺮات اﺿﺎﻓﯽ ﺧﺎرج ﺷﻮﻧﺪ .

حال ۱۰۰ ﻣﯿﮑﺮوﻟﯿﺘﺮ ﻣﺤﻠﻮل ﺳﻮﺑﺴﺘﺮا- رﻧﮕﺰا ﺑﻪ ﭼﺎﻫﮏ ها اﺿﺎﻓﻪ ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ و ﺑﻪ ﻣﺪت ۱۵ دﻗﯿﻘﻪ در دﻣﺎی اﺗﺎق و ﺗﺎرﯾﮑﯽ اﻧﮑﻮﺑﻪ ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ .
ﺑﺎ اﺿﺎﻓﻪ ﮐﺮدن ۵۰ ﻣﯿﮑﺮوﻟﯿﺘﺮ ﻣﺤﻠﻮل ﻣﺘﻮﻗﻒ ﮐﻨﻨﺪه ﺑﻪ ﻫﺮ ﭼﺎﻫﮏ ، اداﻣﻪ واﮐﻨﺸﻬﺎی آﻧﺰﯾﻤﯽ را ﻣﺘﻮﻗﻒ ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ . ﺑﺮای ﺳﻨﺠﺶ ﺟﺬب ﻧﻮری ﻫﺮ ﭼﺎﻫﮏ از دﺳﺘﮕﺎه اﻻﯾﺰارﯾﺪر ﺑﺎ ﻓﯿﻠﺘﺮ ۴۵۰nm اﺳﺘﻔﺎده ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ و ﺟﺬب ﻧﻮری ﺗﻤﺎﻣﯽ ﭼﺎﻫﮑﻬﺎ را در ﻣﻘﺎﺑﻞ ﺑﻼﻧﮏ ﻗﺮاﺋﺖ ﻧﻤﺎﯾﯿﺪ (ﺗﻮﺻﯿﻪ ﻣﯽ ﺷﻮد از ﻓﯿﻠﺘﺮ ۶۳۰nm ﺑﻌﻨﻮان ﻓﯿﻠﺘﺮ رﻓﺮاﻧﺲ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﻮد)

تست HBS Ag به روش الایزا
تفسیر نتایج
ﺟﻮاب ﻣﻨﻔﯽ ﻧﺸﺎﻧﺪﻫﻨﺪه ﻋﺪم وﺟﻮد HBsAg و ﯾﺎ ﻏﯿﺮ ﻗﺎﺑﻞ ﺳﻨﺠﺶ ﺑﻮدن آﻧﺘﯽ ژن (در ﻣﺮاﺣﻞ اوﻟﯿﻪ ﻋﻔﻮﻧﺖ) ﻣﯽ ﺑﺎﺷﺪ .
ﺟﻮاﺑﻬﺎی ﻣﺜﺒﺖ ﺑﺎﯾﺪ ﻣﺠﺪدا ﺗﮑﺮار ﺷﻮﻧﺪ . ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎی ﻣﺜﺒﺘﯽ ﮐﻪ در ﺗﮑﺮار ﻣﺠﺪد ﻣﻨﻔﯽ ﻣﯿﺸﻮﻧﺪ ، ﺑﺎﯾﺪ ﻣﻨﻔﯽ ﮔﺰارش ﮔﺮدﻧﺪ .
ﻣﺜﺒﺖ ﺷﺪن آزﻣﺎﯾﺶ در ﻣﺮﺗﺒﻪ اول ﻣﯽ ﺗﻮاﻧﺪ ﺑﻪ ﺳﺒﺐ ﺧﻄﺎی ﮐﺎری در ﺷﺴﺘﺸﻮ ﯾﺎ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺑﺮداری ﺑﺎﺷﺪ . در ﺻﻮرت ﻣﺜﺒﺖ ﺷﺪن آزﻣﺎﯾﺶ در ﻣﺮﺣﻠﻪ ﺗﮑﺮار آن ،ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺑﺎﯾﺴﺘﯽ ﺑﺎ روﺷﻬﺎی ﺗﺎﯾﯿﺪی ﺧﻨﺜﯽ ﺳﺎزی (Neutralization) ﻣﻮرد ﺗﺎﯾﯿﺪ ﻗﺮار ﮔﯿﺮد.
برای تایید ابتلای فرد به هپاتیت B میتوان از روش الکتروکمی لومیسانس ECL بهره برد…

این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و‌قابل گزارش است:
میانگین جذب نوری کمتر از ۰٫۱۵ برای کنترل منفی
در صورت بیشتر بودن این جذب نوری،احتمالا شستشو بصورت صحیح صورت نگرفته است …باید ازمایش را تکرار کرده و در مرحله شستشو نهایت دقت را بکار ببرید.

جذب نوری بیشتر از ۰٫۸ برای کنترل مثبت

پاسخ دهید