تست اوره آز (موارد کاربرد،تشخیص،روش ساخت و کنترل کیفی)

تست اوره آز برای تشخیص توانایی ارگانیسم برای شکستن اوره، با تولید آنزیم اوره آز می باشد. آگار اوره در سال 1946 توسط کریستنسن (Christensen) برای افتراق باسیل های روده استفاده شد.

اصول تست اوره آز

اوره (Urea) محصول دکربوکسیلاسیون (decarboxylation) آمینو اسیدها می باشد. زمانی که اوره هیدرولیز می شود، CO2 و آمونیاک تولید می کند. تولید آمونیاک باعث قلیایی شدن محیط می شود و تغییر pH توسط تغییر رنگ معرف فنل رد، از زرد یا نارنجی روشن (در pH برابر 6.8) به قرمز یا صورتی (در pH برابر 8.1) مشخص می شود.

ارگانیسم های اوره آز مثبت می توانند تمامی محیط را ظرف 24 ساعت به رنگ صورتی در بیاورند. برای ارگانیسم های مثبت ضعیف ممکن است چند روز طول بکشد. ارگانیسم های منفی تغییر رنگی ایجاد نمی کنند و یا محیط به رنگ زرد (نتیجه ی تولید اسید) می ماند.

تست اوره آز سریع (Rapid Urease Test یا RUT)

تست اوره آز سریع یک تست تشخیصی معروف برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری (Helicobacter pylori) می باشد. این تست سریع، ارزان و ساده بوده و تشخیص دهنده ی وجود آنزیم اوره آز، درون یا روی موکوس معده (gastric mucosa) می باشد.

همچنین این تست با نام تست CLO یاCampylobacter-like organism test نیز شناخته می شود. برای این تست از روشی به نام اندوسکوپی گاستریک (gastric endoscopy) و بیوپسی برای برداشتن سلول های پوششی معده استفاده می شود.

این تست در زمان گاستروسکوپی (gastroscopy) انجام می شود. بیوپسی از موکوس antrum معده انجام شده و در محیط کشت اوره همراه با یک معرف مثل فنل رد، قرار می گیرد.

آنزیم اوره آز توسط هلیکوباکتر پیلوری ساخته شده و اوره را به آمونیاک تبدیل می کند که این کار هم باعث افزایش pH محیط شده و باعث تغییر رنگ محیط از زرد (منفی) به قرمز (مثبت) می شود.

تست تنفسی اوره (Urea Breath Test)

تست تنفسی اوره یک تست غیر تهاجمی برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری بوده و اساس این تست بر فعالیت آنزیم اوره آز استوار است. حساسیت و اختصاصیت این تست بالا می باشد.

برای این تست، بیمار اوره ی نشان دار شده با رادیواکتیو را می خورد (هم می توان از کربن 14 رادیواکتیو استفاده کرد و یا از کربن 13 غیر رادیواکتیو).

اگر عفونت وجود داشته باشد، آنزیم اوره آز تولید شده توسط هلیکوباکتر پیلوری، اوره را به آمونیاک هیدرولیز کرده و بی کربنات نشان دار شده به عنوان CO2 ، در بازدم خارج می شود.

CO2 نشان دار شده توسط دستگاه scintillation counter (برای کربن 14) و isotope ratio mass spectrometry و mass correlation spectrometry (برای کربن 13) شناسایی می شود.

موارد استفاده تست اوره آز :

1 : این تست برای افتراق ارگانیسم ها، بر اساس توانایی آن ها برای هیدرولیز اوره، توسط آنزیم اوره آز می باشد.

2 : تست اوره آز می تواند به عنوان بخشی از فرایند شناسایی چندین جنس و گونه ی خانواده انتروباکتریاسه انجام شود مثل پروتئوس (Proteus)، کلبسیلا (Klebsiella) و برخی گونه های یرسینیا (Yersinia) و سیتروباکتر (Citrobacter) و همچنین برخی از گونه های کورینه باکتریوم (Corynebacterium)

3 : همچنین تست اوره آز برای تشخیص گونه کریپتوکوکوس (Cryptococcus spp)، بروسلا (Brucella)، هلیکوباکتر پیلوری (Helicobacter pylori) و دیگر باکتری های تولید کننده ی آنزیم اوره آز استفاده می شود.

همچنین با هلیکوباکتر پیلوری بیشتر آشنا شوید

محیط کشت استفاده شده در تست اوره آز :

آگار اوره کریستنسن (Christensen’s Urea Agar) :

ترکیبات (مواد تشکیل دهنده در هر لیتر آب مقطر)
20.0 gmاوره (Urea)
5.0 gmسدیم کلراید (Sodium Chloride)
2.0 gmمونو پتاسیم فسفات (Monopotassium Phosphate)
1.0 gmپپتون (Peptone)
1.0 gmدکستروز (Dextrose)
0.012 gmفنل رد (Phenol Red)
15 gmآگار (Agar)

pH نهایی برابر 6.7 ± 0.2 در 25 درجه سانتی گراد

آماده سازی محیط کشت اوره (محیط اوره آگار) :

1 : مواد تشکیل دهنده را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و از فیلتر استریل (با اندازه منفذ 0.45 mm) عبور می دهیم.

2 : آگار را در 900 میلی لیتر از آب مقطر ریخته و آن را حرارت داده تا به خوبی محلول گردد.

3 : در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 15 psi (حدود 100 کیلوپاسکال) به مدت 15 دقیقه اتوکلاو می کنیم.

4 : اجازه دهید آگار خنک شده و دمای آن به 50 تا 55 درجه سانتی گراد برسد.

5 : به صورت استریل، 100 میلی لیتر اوره ی استریل و فیلتر شده را به محلول آگار سرد شده اضافه کرده و به خوبی آن ها را مخلوط می کنیم.

6 : به هر یک از لوله های استریل (13 در 100 میلی متری)، 4 تا 5 میلی لیتر از محلول به دست آمده را ریخته و لوله ها را طی خنک شدن، به صورت شیب دار قرار می دهیم تا سفت شوند.

روش تست اوره آز (Procedure of Urease Test) :

1 : کشت دادن سطح آگار شیب دار اوره با بخشی از کلنی ایزوله شده و یا انداختن 1 تا 2 قطره از محیط کشت برین هارت اینفیوژن براث کالچر (BHI یا Brain-Heart Infusion Broth Culture) روی سطح شیب دار محیط.

2 : گذاشتن سست درپوش لوله و انکوبه کردن آن در دمای 35 تا 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور به مدت 48 ساعت تا 7 روز.

3 : بررسی کردن رنگ لوله برای ایجاد رنگ صورتی، به مدت 7 روز.

بررسی نتایج آزمایش:

واکنش مثبت : ایجاد رنگ قرمز شدید تا صورتی روشن طی 15 دقیقه تا 24 ساعت.

مثال : گونه پروتئوس (Proteus spp)، گونه کریپتوکوکوس (Cryptococcus spp)، گونه کورینه باکتریوم (Corynebacterium spp)، هلیکوباکتر پیلوری (Helicobacter pylori)، گونه یرسینیا (Yersinia spp)، گونه بروسلا (Brucella spp) و غیره.

واکنش منفی : عدم وجود تغییر رنگ
مثال : اشرشیا (Escherichia)، شیگلا (Shigella)، سالمونلا (Salmonella) و غیره.

کنترل کیفیت تست اوره آز (Quality Control of Urease Test) :

مثبت : پرتئوس ولگاریس_ Proteus vulgaris (ATCC13315)

مثبت ضعیف : کلبسیلا پنومونیه_ Klebsiella pneumoniae(ATCC13883)

منفی : اشرشیا کلی _ Escherichia coli(ATCC25922)

محدودیت های آزمایش :

برخی از ارگانیسم ها به سرعت اوره را تجزیه می کنند (مثل بروسلا و هلیکوباکتر پیلوری)، در صورتی که بقیه به آرامی این کار را انجام می دهند.

توصیه می شود که تست های بیوشیمیایی و سرولوژیک به منظور شناسایی کامل، بر روی کلنی های کشت خالص صورت گیرند.

به منظور تسهیل رشد و واکنش هیدرولیز اوره، تلقیح را از سوسپانسیون آبگوشت انجام ندهید.

پس از زمان انکوباسیون طولانی ممکن است واکنش قلیایی مثبت کاذب دیده شود. برای رخ ندادن این اتفاق، تست را با یک کنترل (یک لوله ی تلقیح نشده آگار اوره) همراه با لوله ی تلقیح طی زمان طولانی انکوباسیون، چک می کنیم.

آگار اوره شیب دار را حرارت ندهید، زیرا اوره به آسانی با حرارت تجزیه می شود.

برای شناسایی گونه های پروتئوس، آگار اوره شیب دار باید طی 6 ساعت پس از تلقیح، برای وجود واکنش بررسی شود.

آگار اوره نباید برای تعیین سرعت فعالیت اوره آز استفاده شود زیرا ارگانیسم ها در توانایی و سرعت هیدرولیز با یکدیگر تفاوت دارند.

عدم انکوباسیون این محیط کشت با درب سست می تواند باعث مشکل در نتایج گردد.

اوره به نور حساس بوده و می تواند دچار اتوهیدرولیز شود. پس در دمای 2 تا 8 درجه و در تاریکی آن را نگهداری کنید.

منبع

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.