تشخیص باکتری ویبریو

ویبریو (تشخیص آزمایشگاهی،روشهای کشت و مورفولوژی)

چهار جنس ویبریو، ائروموناس، پلزیوموناس و فتوباکتریوم در خانواده ویبریوناسه قرار دارند. مهمترین ویبریوهای پاتوژن عبارتند از ائروموناس و پلزیوموناس و ویبریو. بیشتر این ویبریوها آزاد در آب زندگي ميکنند، اما بعضيها فقط وقتي آب با مدفوع آلوده شود در آن یافت ميگردند.

ویبریو

ویبریوها باکتریهای گرم منفي خمیده ( Sشکل) به طول ۲ -4 µmهستند که در کشت کهنه پلئومورفیک بوده درحالیکه در کشت جوان داراي انتهاي گرد و نقطه اي و در محیط مایع به صورت دوتایي یا زنجیره کوتاه دیده ميشوند.

آنها به وسیله فلاژل قطبي غلافدار (حرکت سریع) متحرک بوده، فاقد اسپور و کپسول، هــوازي، بيهوازي اختیاري، شیمیوارگانوتروف و تبدیل کننده
نیترات به نیتریت هستند، در حرارت 16تا 4۲درجه سلسیوس و در pHبین 6/8تا ( ۹/6در کمتر از 6/8رشد نميکنند و کشته میشوند، بنابراین به محیط اسیدی معده حساس هستند) رشد مي نمایند.

اکسیداز مثبت (به جز ویبریو متچنیکوویي )و کاتالاز مثبت اند. اکثراً در غلظت کم نمک رشد خوبي دارند و عده اي هالوفیلیک اند. کربوهیدراتها را بدون تولید گاز تخمیر مينمایند، بیشتر ویبریوها داراي آنزیمهـاي خارج سلولی (آمیلاز، کتیناز، ژلاتیناز، لسیتیناز و لیپاز) هستند که در بیماریزایی آنها نقش دارند.

اکثراً ساپروفیت یا کومنسال بوده و برخي (ویبریو کلرا بیوتیپ کلرا و التور و ویبریو پاراهمولیتیکوس) براي انسان بیماریزا هستند.

در آبهای شور و شیرین، مدفوع انسان و حیوانات و مواد دیگر یافت ميشوند. روي محیطهای کشت معمولي به خوبی رشد ميکنند و رشدشان در محیط مایع آب پپتونه (پس از 6-۹ساعت) به صورت یک لایه در سطح دیده ميشود.

هایبرگ بر اساس توانایی تولید اسید از گلوکز، مانوز و آرابینوز، ویبریوها را گروه بندی نمود. ویبریو کلرا به دلیل تولید اسید از گلوکز و مانوز و فقدان توانایی تولید اسید از آرابینوز در گروه یا دسته اول (I)هایبرگ قرار میگیرد.

ویبریو کلرا

ویبریو کلرا در اولین جداسازی به صورت باسیل خمیده شبیه کاما است که در کشتهای طولانی به صورت باسیلهای مستقیم مشابه باکتریهای گرم منفی روده ای میباشند.
سویه های ویبریو کلرا را توسط بیوتیپ و سروتیپ (بر اساس آنتیژن ۲۰6 ،Oسروتیپ تقسیم بندی میشوند) شناسایي ميکنند.

ویبریو کلرا دارای 4بیوتیپ کلرا، التور، آلبنسیس و پروتئوس است. هم بیوتیپ کلرا و هم التور سبب وباي کلاسیک شده و سروتیپ O1هستند. البته بعضي ویبریوهای سروتیپ O1هم وجود دارند که توکسین کلرا را تولید نمیکنند و نمي توانند بیماري ایجاد نمایند.

بیوتیپهای آلبنسیس و پروتئوس با آنتی بادی ضد آنتي ژن O1آگلوتینه نمی شوند و معمولاً سویه هاي غیرآگلوتینه یا ویبریوي غیرکلرا نامیده ميشوند، بنابراین سه گروه از سویه های ویبریوکلرا وجود دارد:

( VCO1)1عامل وبا؛( O1)۲نان توکسی ژنیک یا آتیپیک که عامل وبا ميشوند و ( NAG )3یا NCVکه فقط گاهي سبب وبا ميشوند، اما اغلب اسهال خوني ميدهند.

اگر سویه اي به عنوان O1شناسایي شود، آن را بسته به فعالیت بیوشیمیایي در بیوتیپ التور یا کلرا دسته بندی ميکنند. بیوتیپ کلرا با التور تفاوتهایی دارند که در جدول و شکلهای زیر نشان داده شده است.

لازم به ذکر است که بیوتیپ التور اغلب از افراد ناقل مزمن ایزوله میگردد. بالاخره، هم بیوتیپ کلرا و هم التور را ميتوان با آنتیژنهای A و Bو Cبه این صورت تیپ بندي کرد.

تشخیص آزمایشگاهی:

استفاده از روشهای معمولي (بدون تلاش و کوشش در بکار بردن محیط اختصاصي)
استفاده از روشهای معمولي و جستجوي کلني، انجام تست اکسیداز بر روي کلنی رشد نموده در پلیت
استفاده از محیط . T.C.B.Sبعلاوه محیطهای معمول در آزمایشگاه
استفاده از روشهای اختصاصي که شانس جداسازي ویبریو کلرا، V. parahemolyticus و سایر ویبریوها را افزایش ميدهد

جمع آوري نمونه:

برداشت نمونه توسط سوآب رکتال، یا ظرف تمیز و یا از شیلنگ لاستیکي فاقد مواد ضدعفونی کننده انجام ميگیرد. نمونه هاي خارج رودهاي از طریق معمول جمع آوري ميگردد.

نباید از لگن بیمار که حاوي مواد ضد عفوني کننده باکتري کش است، نمونه برداري نمود. نمونه برداشت شده به ظرف دربسته منتقل ميگردد که حاوي رطوبت بوده و سریعاً به آزمایشگاه فرستاده ميشود. کشت استفراغ بیمار در مراحل اولیه بیماری بسیار مفید است.

محیطهای انتقالي و نگهدارنده:

ویبریوها به خشکي، نور و pHاسیدي حساس بوده و بهوسیله فلور نرمال روده از رشدشان جلوگیري ميشود، از این رو چنانچه شرایط کشت فراهم نبود باید در محیطهای انتقالي کشت داده شوند.

الف- باکتری در محیط نیم جامد Carry-Blairتا چهار هفته زنده ميماند و از این محیط برای انتقال نمونه ها میتوان استفاده کرد. از محیط انتقالی bufferedglycerol saline نباید برای انتقال ویبریوها استفاده نمود.

ب- محیط انتقالی Salt Sea Waterمحیط نسبتاً مناسبی برای انتقال باکتری است.

ج- اگر محیط انتقال در دسترس نبود، کاغذ (به اندازة ۲ × 1/۲اینچ) آغشته به نمونه مدفوع آبکی را داخل پلاستیک قرار داده و سپس به آزمایشگاه انتقال دهید و بر روی محیطهای کشت عمومی و اختصاصی کشت نمایید.

د- محیط کشت آب پپتونه قلیایی (Alkalin peptone water) A.P.Wبا pH= 8.6که به عنوان محیط غني کننده هم مورد استفاده قرار میگیرد.

آزمایش مستقیم:

در مرحله حاد بیماري در مدفوع بیماران دچار اسهال دانه هایي شبیه برنج (مدفوع آب برنجي) مشاهـده ميشود که در این حالت ویبریوها به شکل خالص به تعداد 1۰6تا 1۰8در یک میلیلیتر وجود دارند.

با قرار دادن مقداري نمونه بین لام و لامل و مشاهدة حرکت باکتري (حرکت سریع) توسط میکروسکوپ زمینه تاریک Dark feld و فازکنتراست و در لام رنگ شده، باکتری ها به صورت کاما (ویرگول شکل) مشاهده ميشوند.

چنانچه از کلنيهاي محیط جامد اسمیر تهیه و رنگ آمیزي شود،باسیلهای مستقیم و خمیده و در محیط براث اگر در فاز Log باشند به شکل کوکوئید و کوکوباسیل مشاهده ميگردد و در فاز Stationary به شکل خمیده یا کاما شکل دیده ميشوند.

قرار دادن یک قطره آنتی بادی بر روي نمونه مدفوع آبکی که در آن باکتریها متحرک هستند و مشاهده توقف حرکت آنها دلالت بر وجود ویبریو است.

نکته مهم: در کشتهای تازه ویبریوها خمیده یا به شکل کاما و S هستند. گاهی اوقات به شکل باسیل مستقیم دیده شده که از سایر باسیلهای روده ای از نظر مورفولوژی غیرقابل افتراقند.

کشت روی محیطهای مختلف

محیط Blood Agar

نمونه های مشکوک به ویبریو کلرا را بعد از انتقال به آزمایشگاه روی این محیط و مکانکی میبرند. بعد از ۲4ساعت از کشت، ویبریو کلرا کلني صاف و برجسته میدهد که شبه همولیز که ناشي از هضم RBC در ویبریو کلرا بیوتیپ Eltor است،مشاهده ميگردد (ویبریوکلرا همولیز ایجاد ميکند.)

محیط نوترینت آگار

کلني بعد از ۲4ساعت در 3۷ º cبه اندازه 1-۲ mmقطر دارد و دیسک مانند و شفاف است و با تاباندن نور حالتي شبیه قوس و قزح دارد و به رنگ مایل به سبز یا آبي کم رنگ مشاهده ميشود.

محیط مکانکی آگار

همة ویبریوها بجز V.vulnifcus بر روي محیط مکانکی آگار رشد ميکنند. کلنی این باکتریها بر روي پلیت حاوی محیط مکانکی آگار شبیه لاکتوز مثبتها بوده و با انتروباکتریاسه اشتباه ميشوند مگر اینکه تست اکسیداز انجام گیرد، اگرچه روي محیط مکانکي آگار ممکن است اکسیداز منفي کاذب نشان دهند.

باید توجه داشت که از محیط ائوزین متیلن بلو به علت اینکه ویبریوها بر روی آن رشد نمیکنند، استفاده نمیشود.

محیط کشت تیوسولفات سیترات بایل سالت سوکروز آگار :T.C.B.S

با رشد ویبریوها روی این محیط بعد از ۲4-48ساعت، کلنيها صاف، محدب و برجسته با لبة نازک و زرد رنگ هستند که نشاندهنده مصرف قند لاکتوز است (که زردي آن ناشي از تخمیر قند سوکروز و ایجاد pHاسیدي و تغییر رنگ معرف بروموتیمول بلو توسط باکتری است) و در عدهاي کلني سبز تخممرغي شکل که سوکروز منفي هستند، مشاهده ميشود.

کلنی ویبریوکلرا و ویبریو آلژینولیتیکوس به علت سوکروز مثبت بودن زرد میشود .ویبریو میمیکوس، پاراهمولیتیکوس و ولنیفیکوس سوکروز منفی بوده و کلنی سبز میدهند.

این محیط برای ایزوله کردن ویبریو کلرا از مدفوع که حاوی فلور نرمال است، استفاده می گردد. برخلاف سایر ویبریوها روی این محیط ویبریو هولی ساه V. hollisae رشد نمیکند.

نکته: سودوموناس، پلزیوموناس و ائروموناس قابلیت رشد بر روی . T.C.B.Sرا داشته و کلنی آبی میدهند.

نکته: در مناطقی که وبا به صورت اندمیک است، کشت مدفوع بر روی محیط انتخابی مانند T.C.B.S و محیطهای غنی کننده نظیر آب پپتونه قلیایی میتواند مفید باشد؛ با این حال، کشتهای رایج مدفوعی بر روی محیطهای انتخابی نظیر . T.C.B.Sدر نواحی غیر اندمیک ضرورتی نداشته و مقرون بهصرفه نیست.

محیط توروکولات تلوریت ژلاتین آگار T.T.G.A

بعد از ۲4ساعت کلني ریز، شفاف، با مرکز سیاه رنگ یا خاکستري مایل به سیاه و یک هاله کدر (قهوه اي کمرنگ) در اطراف کلني ویبریو کلرا مشاهده ميگردد که پس از 48 ساعت کلني درشتتر 3-4 mm با مرکز سیاه و هاله شفاف در اطراف آن دیده ميشود.

پروتئوسها هم به علت تجزیه تلوریت و آزاد نمودن شبه فلز تلوریم کلني سیاه ایجاد مي نمایند، ولي چون آنزیم ژلاتیناز ندارند،هاله ای در اطراف کلني ایجاد نميشود، از این لحاظ از ویبریوها متمایز میشوند.

از این محیط برای بررسي و بدست آوردن باکتري از ناقلین بخصوص ویبریو Eltor استفاده ميگردد.

مکانکي و CIN ممکن است نتایج منفي کاذب حاصل شود. (در اینجا لازم به ذکر است که باکتریهای خانواده انتروباکتریاسه اکسیداز منفي هستند، ولي ائروموناس، پلزیوموناس و سودوموناسها اکسیداز مثبت هستند.)

محیط سیستین فاقد لاکتوز و الکترولیت

باکتري را بر روی محیط مذکور کشت داده، چنانچه ویبریوها هالوفیلیک باشند بر روی این محیط رشد نميکنند، درحالیکه ویبریوهاي غیرهالوفیلیک (کلرا، التور و میمیکوس) رشد ميکنند. این محیط دارای pH = ۷/۵ و معرف آندراد Andrade,s است.

استفاده از ماده 2,4 Diamino-6,7 diisopropyl pteridine

که به صـورت پـودر و دیسـک وجـود دارد. انتروباکتریاسـه و سـودوموناس و آئروموناس نسـبت به این ترکیـب مقاومند،درحالیکـه پلزیومونـاس بـه غلظـت 1۰ میکروگـرم و ویبریـو بـه غلظـت 1۵۰هـم حسـاس اسـت.

از طرفـی پلزیومونـاس بـر روی محیـط T.C.B.Sرشـد نميکنـد، از ایـن رو از یکدیگـر قابـل تمایز می باشـند.

نکته: در تمام دنیا ویبریو کلرا به O129حساس هستند به جز ویبریو کلرا O1 در هند که مقاوم است.

تست ایجاد رشته String test

چنانچه کلني مشکوک به ویبریو با ترکیب دیاکسيکولات سدیم %۰/۵مجاور شود، تنها بیوتیپ التور ویبریو کلرا تولید رشتة بلند و کشیده مي نماید و پس از 4۰-6۰ ثانیه رشته مزبور قوی تر و چسبنده تر ميشود، درحالیکه سایر ویبریوها و از جمله پاراهمولیتیکوس تولید رشته نميکنند.

استرینگ تست وبا

تشخیص ویبریو

منبع:ماهنامه تشخیص آزمایشگاهی
دکتر میرنژاد

دیدگاه‌ خود را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *