تشخیص اورئوس بیماریزا

تشخیص آزمایشگاهی استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین

استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین یک باکتری است که باعث چندین عفونت مقاوم به درمان در انسان میشود. این باکتری با روند انتخاب طبیعی به آنتی بیوتیکهای ضد باکتریایی، ازجمله پنی سیلین ها و سفالوسپورینها مقاوم شده است. البته این مقاومت باعث نمیشود که ارگانیسم به طور ذاتی بیماریزا تر از سویه های استافیلوکوکوس اورئوس فاقد مقاومت به آنتی بیوتیک باشد، بلکه درمان عفونتهای ناشی از MRSAبا آنتی بیوتیکهای استاندارد را بسیار دشوار ساخته است، ازاین رو این باکتریها بسیار خطرناک هستند.

MRSA به طور ویژه ای در بیمارستانها، زندانها و خانههای سالمندان دردسرآفرین است و بیماران با زخم های باز، تحت اعمال تهاجمی و دارای سیستم ایمنی ضعیف نسبت به سایر مردم در معرض خطر بیشتری دارند.

تاریخچه

استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین نخست در اوایل ۱۹۶۰ گزارش شد، و اکنون به عنوان پاتوژن عمده اکتسابی بیمارستانی در دنیا شناخته میشود. مقاومت زمانی رخ میدهد که ارگانیسم دارای ژن ،mecA تولید پروتئین اتصالی به پنیسیلین تغییریافته، PBP2a و اکساسیلین با 2mg/L MIC یا متیسیلین با 4mg/L MIC و یا هردوی آنها کند. بیماران عفونی و دارای کلون باکتری، مخزن MSRA هم در بیمارستان و هم در جامعه است.

بیشتر آلودگی از راه تماس با کارکنان بهداشتی انجام میگیرد.تشخیص آزمایشگاهی و آزمون حساسیت به هنگام، در درمان، کنترل و پیشگیری از عفونتهای MRSA بسیار مهم است.

روش های تشخیص آزمایشگاهی MRSA

آزمایشگاههای تشخیص پزشکی و آزمایشگاههای مرجع جهت برآورد شیوع MRSAکلیدی هستند. تکنیکهای تازه ای برای شناسایی و تشخیص MRS به کار می رود،روی هم رفته باکتری باید از خون، ادرار، خلط یا دیگر مایعات قابل کشت بدن جداسازی شود و به درستی کشت شوند.

روش سریع و آسان برای تشخیص عفونت MRSA وجود ندارد.درمان اولیه اغلب بر پایه حدس قوی پزشک معالج است،

ازاین رو هر درنگی در درمان این نوع عفونت میتواند نتایج مرگباری به همراه داشته باشد. تکنیکهای تشخیصی پیشرفته شامل PCRکمی و کیفی هستند، که به طور روزافزون جهت تشخیص و شناسایی سویه های MRSAدر آزمایشگاههای بالینی بکار گرفته میشوند.

آزمون آزمایشگاهی معمول دیگر آزمون آگلوتیناسیون سریع لاتکس است،که پروتئین PBP2a را شناسایی میکند. PBP2a واریانتی از پروتئین اتصالی به پنی سیلین است که به استافیلوکوکوس اورئوس توانایی مقاومت به اکساسیلین را اعطا میکند.

استفاده از روش های کشت غربالگری آزمایشگاهی،MRSAتعادل پیچیده بین سرعت نتایج، حساسیت، اختصاصیت و هزینه است. امروزه بیشتر روشهای غربالگری برپایه استفاده از روشهای کشت است. به علت وجود تعداد زیادی از ارگانیسمهای “آلوده کننده” که از محلهای غیراستریل در سوابها ناشی میشوند، جداسازی از سوابهای غربالگری میتواند یک روند طولانی باشد.

کشت در محیطهای غنی شده بر پایه براث

بیشتر برای افزایش حساسیت استفاده میشود، هرچند ایجاد نتایج سریع با آنها هزینهبر است. بیشتر NaCl به همراه متیسیلین یا اکساسیلین و در سالهای بسیار اخیر سفوکستین، به محیطهای بر پایه براث اضافه میشود. از ترکیبات نشانگر نیز میتوان جهت نشان دادن وجود MRSA استفاده کرد.

کشت در محیط آگار جامد

روش استاندارد جهانی جهت غربالگری و جداسازی MRSA با استفاده از محیط آگار جامد وجود ندارد. محیطهای انتخابی زیادی در دسترس هستند و متکی برمهارکنندههایی مانند NaCl و یا آنتی بیوتیکها هستند و به همراه نشانگر pH استفاده میشوند،برای نمونه، آگار نمک مانتیول حاوی NaCl %7 به همراه /mg 4L متیسیلین یا 2mg/L اکساسیلین، محیط برد پارکر به همراه 8 میلی گرم سیپروفلوکساسین، آگار مولرهینتون با NaCl %4 و /mg 4L اکساسیلین هستند.

حساسیت در 24ساعت تا 48 ساعت انکوباسیون متفاوت بوده و اغلب برای حصول نتیجه قابل قبول موردنیاز است.

محیط های رنگزا

یک محیط رنگزا اخیراً ساخته شده است که رشد اولیه و انتخاب را ترکیب کرده و MSRAرا از استافیلوکوکوس کوآگولاز منفی تشخیص میدهد. این محیطها در مقایسه با محیطهای سنتی ویژگی و حساسیت بهبود یافته ای را نشان میدهند، اما جهت حصول نتیجه > %8۵ نیازمند 48 ساعت انکوباسیون هستند.

تست کواگولاز

روش لوله ای
بلاسمای سیتراته خرکوش یاانسان رابه نسبت ۵:۱ رقیق کنید( ۵سرم و ۱بلاسما) سبس /.۱میلی لیتر ازکشت جوان استافیلوکوکوس اورئوس رابه لوله محتوی /.۵ میلی لیتر پلاسمای رقیق شده اضافه نموده ومد ت ۱تا4 ساعت در کرمخانه 37 درجه سانتیگراد قرار دهید درصورت کواگولاز مثبت بودن باکتری،پلاسمای موجود در لوله منعقد می شود و به صورت لخته مشاهده می شود.

روش لام
دریک قطره سرم فیزیولوزی مقداری از کلنی استافیلوکوکوس اورئوس رابه صورت یکنواخت حل نموده سبس یک قطره بلاسمای رقیق شده به آن اضافه نمایید و مرتبا بهم بزنید اگر استاف کواگولاز مثبت باشد درعرض۱۰ثانیه آگلوتیناسیون به صورت ذرات توده مانند در روی لام مشاهده می شود.

تست DNase

استافیلوکوکوس اورئوس رابروی محیط DNase به صورت نقطه ای یاخطی کشت داده وبرای مدت ۱8تا 24 ساعت دردمای 37 درجه سانتیگراد قرار دهید بعد بر روی آن اسیدکلریدریک نرمال بریزید. درصورتیکه هاله شفاف اطراف کلنی مشاهده شد نشان دهنده حضور آنزیم دزوکسی ریبونوکلئاز درباکتری است.

تخمیر مانیتول

استافیلوکوکوس اورئوس در محیط مانیتول سالت آگار باتخمیر مانیتول ایجاد اسید می کند. مانیتول سالت آگار محیط انتخابی و افتراقی استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. این محیط دارای 7/۵ درصد نمک است و نیز دارای معرف فنل رد است که درصورت ایجاد اسید معرف از رنگ صورتی مایل به قرمز به رنگ زرد تغییر رنگ پیدا می کند.

حساسیت به نووبیوسین

استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به نووبیوسین حساس است .باکتری را بر روی محیط مغذی به صورت یکنواخت کشت داده بعد دیسک نووبیوسین (حاوی۵میکروکرم) رادرسطح محیط قرار داده و پلیت رادردمای 37 درجه سانتیگراد به مدت ۱8 ساعت نگهداری کنید .ایجاد هاله عدم رشد دراطراف دیسک نشانه حساسیت به نووبیوسین است.

تست فسفاتاز

استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرممیدیس دارای آنزیم فسفاتاز می باشند. باکتری را درمحیط فنل فتالئین فسفات آگار کشت داده و بعد به مدت ۱8تا 24 ساعت درحرارت 37 درجه سانتیگراد نکهداری نمایید. بعد /.۱ میلی لیتر امونیاک را در داخل درب بتری ریخته و پلیت رابه مدت ۱دقیقه یا بیشتر به طور وارونه قرار دهید.کلنیهایی که دارای آنزیم فسفاتاز هستند به رنک صورتی تغییر رنگ می یابند.

روشهای مولکولی

روشهای مولکولی که ژن mecA را بجای MIC شناسایی میکنند به عنوان روش مرجع میباشند. بیشتر روشهای مولکولی مورداستفاده جهت تشخیص MRSA بر پایه پرایمرهای مولتیپلکس PCR استوار هستند، که ژنهای خاصی از استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین را تشخیص میدهند.

بسیاری از اینها تنها برای استفاده با کشتهای خالص مناسب هستند، و به علت حضور استافیلوکوکوس کوآگولاز منفی ناقل ژن مقاومت به متیسیلین mecA برای غربالگری سوابها مناسب نیستند. آزمایشهای تکثیری تجاری جدید ژن mecA را در ترکیب با مارکرهای دیگر مثل کوآگولاز مورد هدف قرار داده و نتایج دلگرمکنندهای را نشان داده اند.

استفاده از روش بیولومینسانس

پیشرفتهایی با بیولومینسانس بخصوص در استفاده از آدنیلات کیناز AK وجود دارد، این آنزیم در همه سلولها وجود داشته و تولید ATP از ADP میکند. اندازه گیری AK بسیار حساستر از سیستمهای بر پایه ATP است و امکان تشخیص معمول ۵ ارگانیسم یا بیشتر را در یک نمونه میدهد. داده های اولیه، کارایی و نتایج هم ارز با روشهای کشت معمول را نشان دادند اما نتایج را در عرض ۵ ساعت ارائه میدهند.

تشخیص با استفاده ازکیتهای آگلوتیناسیون

این کیت ها به طور گسترده در دسترس هستند و میتوان از آنها جهت تأیید استافیلوکوکوس اورئوس با شناسایی پروتئین A و فاکتور تجمع استفاده کرد، با این وجود برخی سویه های MRSA مقدار کمی از این پروتئینها را دارند. اکنون کیتهای جدید نیز از طریق شناسایی آنتیژن سطحی عمل میکنند. کیتهای لاتکس دیگر، PBP2a را شناسایی میکنند که در داخل غشای سلولی رخ میدهد و جهت شناسایی نیازمند لیز سلولی هستند.

کیتهای بیوشیمیایی

طیف وسیعی از کیتهای بیوشیمیایی تجاری دستی و خودکار در دسترس است که بر پایه آرایه آزمون بیوشیمیایی استوار است و پروفایل قابل ارزیابی با بانک اطلاعاتی یا جداول را ارائه میدهد.
بسیاری از سیستمهای خودکار جهت تأیید ،MRSA تشخیص بیوشیمیایی استافیلوکوکوس اورئوس را با پانل حساسیت آنتی بیوتیک ترکیب میکنند.

روشهای آزمون حساسیت به متی سیلین و اکساسیلین

این روشها گسترده هستند. روش منفردی وجود ندارد که مناسب برای تمام سویه های MRSA باشد. روشهای استاندارد توسط شیمی درمانی ضدمیکروبی جامعه بریتانیا BSAC و در امریکا به وسیله مؤسسه استاندارد آزمایشگاه بالینی CLSI که قبلا به عنوان NCCLS شناخته میشد منتشر شده است.
حداقل غلظت مهاری [ ]MIC به وسیله روش رقیق سازی، به طور سنتی روش مرجع است. BSAC پیشنهاد کرده است که از آگار مولر هینتون یا کلمبیا با NaCl %2 و cfu/ml ۱۰4 تلقیح شده و انکوبه شده در 30 درجه سانتیگراد استفاده شود.CLSI آگار مولر هینتون با %2 NACL و cfu/ml ۱۰4 تلقیح شده و انکوبه شده در دمای 33-3۵° C را توصیه کرده است.

آزمون حساسیت آنتی بیوتیکی با استفاده از روشهای انتشار دیسک

آزمون حساسیت آنتیبیوتیکی با استفاده از روشهای انتشار دیسک، همچنان روشی با استفاده وسیع مانده است. اما نتایج متاثر از طیفی از فاکتورها شامل محیط، غلظت ،NaClدما، اینکولوم و ماده ی آزمون، قرار میگیرد.

در شماری از بررسی های تازه، با به کار بردن دیسک سفوکسیتین به جای اکساسیلین، اظهارخرسندی بیشتری دیده شده است. در ضمن محیط یا دمای انکوباسیون خاصی موردنیاز نیست و آزمون کمتر تحت تأثیر تولیدکننده بیشتر پنیسیلیناز قرار میگیرد.

دیدگاه‌ خود را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *