روشهای آزمایشگاهی تشخیص باکتری شیگلا در خون و مدفوع

عموماً شیگلا (Shigella) به همراه سالمونلا و یرسینیا در دسته پاتوژنهاي لاکتوز منفي قرار میگیرند، ولي با توجه به همولوژي DNA شیگلا و اشریشیا کلی بسیار به هم نزدیکند و بعضي از محققین معتقدند که شیگلا یک زیرگونه ی اشریشیا کلی است.

گونه هاي شیگلا از اشریشیا کلی به واسطه عدم تخمیر لاکتوز، عدم تحرک، عدم فعالیت دکربوکسیلاسیون لیزین و عدم تولید گاز از تمام کربوهیدراتها قابل شناسایي هستند. گونه هاي شیگلا از گونه هاي سالمونلا به واسطه عدم تحرک و عدم تولید گاز H2S متمایز میشوند.

چهار گونه (گروه) در شیگلا تشخیص داده شده است

شیگلا دیسانتریه
شیگلا فلکسنري
شیگلا بوئیدي
شیگلا سونئی
در طبقه بندي CDC سه گونه اول شیگلا چون از نظر بیوشیمیایي شبیه میباشند، مجموعۀ شیگلا سروگروپ ABC نامیده میشوند. شیگلا سونئی که عامل بیشترین عفونتهاي شیگلا در ایالات متحده امریکا و کمترین در کشور ماست، به راحتی از سه گروه اول تشخیص داده میشود، زیرا برخلاف آنها داراي فعالیت دکربوکسیلاسیون لیزین و بتاگالاکتوزیداز است.

شیگلا دیسانتریه که عامل وخیم ترین حالت بیماري است و اغلب از کشورهای در حال توسعه مانند کشور ما ایزوله گشته و ندرتاً در ایالات متحده آمریکا دیده میشود، از دیگر گروه ها بهواسطه عدم توانایي تخمیر مانیتول و توانایي تولید نوروتوکسین شیگا قابل افتراق است .

همچنین گونه هاي شیگلا را میتوان توسط اختصاصیت آنتي ژنیکی O از یکدیگر افتراق داد.

اطلاعات درباره باکتری شیگلا

شیگلا یکي از عفوني ترین باکتريهاست و خوردن حتي 100 تا ۲00 ارگانیسم میتواند سبب بیماري شود. این ID50 پایین، گونه هاي شیگلا را در آزمایشگاه، به باکتري خطرناکي تبدیل میکند و کارکنان آزمایشگاهها اغلب در هنگام حمل ونقل نمونه هاي حاوي شیگلا آلوده میگردند. بسیاري از مواردي که با شیگلاها آلوده شدهاند کساني بوده اند که آب و غذاي آلوده به مدفوع انساني را خورده اند.

شیگلاها بیش از 30 روز میتوانند در شیر، تخم مرغ، پنیر یا میگو زنده بمانند. عموماً پخش عفونت از منبع انساني و توسط غذا، انگشتان، مدفوع، مگس و اشیاء صورت میگیرد که برخلاف سالمونلا است که اغلب از حیوان آلوده به انسان منتشر میگردد. نوزادان و نوجوانان بسیار به شیگلوز حساسند.

حدود 60 درصد از نوزادان زیر یکسال بعد از مواجهه با شیگلاها دچار دیسانتري میشوند، اما میزان عفونت بعد از 1 سالگي به ۲0 درصد کاهش مییابد. بیشتر بیماريها در جهان در کودکان زیر 10 سال رخ میدهد. شیوع های دیسانتری معمولاً در ارتباط با اجتماعات بسته مانند پادگانها، خانواده ها، کشتیهای مسافربری، بیمارستانهای روانی، مراکز مراقبت روزانه کودکان و زندانها است. دیسانتری باسیلی اغلب در طی جنگها به دنبال استقرار موقت در میادین جنگ روی میدهد.

گونه های شیگلا عامل دیسانتري باسیلي هستند و توانایي بیماریزائي شان اصولاً به قدرت تهاجم آنها به مخاط کولون مربوط میشود. قدرت شیگلا دیسانتریه براي ایجاد بیماري به دلیل توانایي تولید نوروتوکسین شیگا از سایر گونه ها شدیدتر است. م

حققین، اثرات شیگلا را بر روي سلولهای میمون،سلول های کولون و سلولهای غیرکولون انساني و بر روي لوپ ایلئال خرگوش مطالعه کردند و با جمع آوری این اطلاعات تصویري از نحوه ایجاد دیسانتري توسط شیگلا ترسیم نموده اند.

چرخه شیگلا

در چرخه عفونت شیگلا در طي روزهاي اول عفونت شیگلا،باکتري ابتدا روده کوچک را به صورت گذرا آلوده مینماید و اسهال خوني زماني رخ میدهد که کولون عفوني شده باشد.

این عفونت با عفونت فولیکولهای لنفوئیدي کولون که غني از سلولهای M و مشابه پلاکهای پیر در روده ی کوچک است،آغاز میگردد. شیگلا میچسبد، به صورت فاگوسیتوز مستقیم بلعیده میشود و از فاگوزوم آزاد میگردد.

باکتري درون سیتوپلاسم سلول، هر 40 دقیقه یکبار تکثیر یافته و سلول آلوده را پر مینماید. بنظر می آید باکتریها به واسطه رشته های اکتین و در اثر فشار این رشته ها، بدون اینکه به فضاي خارج سلولي وارد شوند، به جلو هل داده میشوند و مستقیماً از سلولي به سلول دیگر میروند. سپس بعضي از شیگلاها به بافت همبند (لامیناپروبریا) حمله کرده و با تحریک پاسخ ایمني سبب ایجاد زخم در محل تهاجم میشوند. پاسخ ایمني شامل PMN ها و غشاء کاذب فیبریني است.

سم شیگا سبب التهاب، از طریق ایجاد ایسکمي و هموراژي میشود. سم شیگایي که وارد جریان خون شود ممکن است سبب سندرم اورمي همولیتیک گردد.

برخلاف سالمونلا، شیگلاها محدود به مخاط و زیرمخاط بوده و ندرتاً ایجاد باکتریمي یا سپسیس میکنند، هرچند امروزه بعضی محققان مطرح نمودند که این باکتریها به خصوص شیگلا فلکسنری را، از اندامهایی مانند غدد لنفاوی، کبد، طحال و غیره ایزوله کرده اند، همچنین آنها مطرح نمودند که شیگلاها به خصوص شیگلا فلکسنری سبب وولوواژینیت بدون عفونت ادراری در بالغین شده و این باکتریها بندرت سبب عفونت ادراری در بالغین میگردند.

علائم

علائم شیگلوزیس ۲ تا 3 روز بعد از مواجهه با شیگلاها آغاز میشود. بیماري با تب ناگهاني، درد شکم و زورپیچ و اسهال همراه است. از دست دادن آب در طول این دو سه روز ممکن است شدید باشد و زندگي کودکان و سایر افراد ضعیف که تحمل از دست دادن آب و الکترولیت ندارند را به خطر بیاندازد، سپس دلپیچه به همراه کاهش دفعات و حجم مدفوع ظاهر میشود.

تشخیص آزمایشگاهی

نمونه هاي مدفوع، خون، ،CSF مایع مفصلی، ضایعات کبدی، غدد لنفاوی، ضایعات واژن و غیره برای شناسایی شیگلاها استفاده میشود. براي تشخیص عامل اسهال خونی میتوان نمونه هاي مدفوع را کشت داد.

البته بهترین نمونه براي کشت، سواب رکتال از زخمي است که در طي سیگموئیدوسکوپي بدست می آید. دیسانتري حاصل از شیگلا را باید از بیماريهاي شبه دیسانتري حاصل از اشریشیا کلی انترواینوازیو، کمپیلوباکتر ژوژني و انگلهاي انتامبا هیستولیتیکا و بالانتیدیوم کلی تشخیص داد.

سیگموئیدوسکوپي نشان میدهد که مخاط پرخون و هموراژیک است و حضور زخمهایي که با غشاء کاذب فیبریني پوشیده شده اند را آشکار میسازد.

مشاهده مخاط، PMN و خون در مدفوع از مشخصه هاي دیسانتري است و نشان میدهد که دیواره روده مورد تهاجم قرار گرفته است. بعد از کشت نمونه ها با بررسی تستهای بیوشیمیایی، جنس و گونه های شیگلا را تأئید قطعی میکنیم.

البته جهت سهولت در کار پس از شناسایی جنس شیگلا میتوان از روشهای سرولوژیک آگلوتیناسیون به وسیله آنتیسرم اختصاصی شیگلا دیسانتری کمک گرفت و به سهولت گونه شیگلا دیسانتری را شناسایی و تأیید نمود.

ضمناً از آنجایی که در بعضی از انواع شیگلا مشابه با سالمونلاها آنتی ژن K وجود دارد، در هنگام آگلوتیناسیون صفحه ای با آنتی سرم O چنانچه آگلوتیناسیون بوجود نیاید، توصیه میشود که شیرابه ای از باکتری را در محلول سرم فیزیولوژی بمدت 30 تا 60 دقیقه در حرارت 100 درجه سلسیوس جوشانده و مجدداً با همان آنتی سرم آزمایش تکرار گردد.

تشخیص سم شیگا

با توجه به اینکه شناسایی ایزوله های تولیدکننده شیگاتوکسین و خود سم در نمونهه ای بالینی بسیار مهم است، در ادامه به روشهای شناسایی آن اشاره میگردد.

به طور کلی تشخیص سم شیگا بر سه محور استوار است:
الف- شناسایی سم شیگاتوکسین Stx
ب- جداسازی و شناسایی ژن تولیدکننده شیگاتوکسین
ج- جداسازی و شناسایی باکتریهای تولیدکننده شیگاتوکسین

سنجش سیتوتوکسیسیته سم با استفاده از کشت سلول

در این روش توکسین Stx بر روی محیط کشت سلولی اثر داده میشود و با مشاهده اثرات سیتوپاتیک میتوان سم را شناسایی نمود. لازم به ذکر است که بهتر است جهت کشت سلولی از سلولهای کلیه میمون سبز آفریقای یا ورو به جای سلولهای هلا استفاده شود.

به این دلیل که سلولهای ورو واجد گیرنده های سطحی Gb3 و Gb4 بوده و به وسیله آنها قادر به شناسایی stx2e که فقط به Gb4 متصل میشود، هستیم ولی سلولهای هلا بدلیل فقدان گیرنده Gb4 در این زمینه از حساسیت کمتری برخوردار هستند.

بدیهی است که این روش دارای حساسیت بسیار بالایی است، ولی بدلیل استفاده از محیط کشت سلولی و روشهای مبتنی بر آن در آزمایشگاههای معمولی استفاده از این روش قابل دسترس نیست و از طرفی نیاز به محیطی بسیار ایزوله و استریل و همچنین دقت بالایی دارد.

روش الیزا

در این روش که از کیت الیزا و روشهای مبتنی بر کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی استفاده میگردد، آنتیژن یا stx به آنتیبادی اختصاصی خود متصل شده و با ایجاد کمپلکس رنگی توسط دستگاه فوتومتر مخصوص که همان دستگاه الیزا ریدر است قابل شناسایی و تیتر است.

بدیهی است که این روش از نظر حساسیت از روش کشت سلولی پایینتر است، اما از نظر اختصاصیت اتصال به آنتی بادی منوکلونال و از طرفی در دسترس بودن، قابلیت تیتراسیون و عدم نیاز به محیط کاملا استریل و ایزوله نسبت به روش کشت سلولی ارجحیت دارد.

روش رسوبی و ایمونودیفیوژن

کمپلکسهای اختصاصی آنتیژن-آنتی بادی و واکنش متقاطع به واسطه روشهای رسوبی در ژل شناسایی میشوند. در این روش آنتی بادی در غلظتهای معین همراه و مخلوط با ژل ساخته میشود.
با حفر چاهکهای متعدد و تزریق موارد مشکوک به سم شیگا در هر چاهک و انکوبه کردن بمدت چند ساعت میتوان خط رسوبی سم شیگا و آنتیبادی اختصاصی آن را در اطراف چاهکهایی که از نظر وجود سم مثبت بوده اند را مشاهده نمود.

این روش در واقع یک متد مشابه به الیزا بوده ولی با مکانیسم ساده تر انجام میگیرد. برای اندازه گیری میزان کمی سم میتوان از غلظتهای استاندارد توکسین به صورت سریالی استفاده نمود و پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت سم مجهول را مشخص نمود.

جداسازی و شناسایی ژن تولیدکننده شیگاتوکسین

دومین راه شناسایی سم شیگا استفاده از روشهای مولکولی و تشخیص ژن کدکننده توکسین در باکتری است. همانطور که در گذشته نیز اشاره گردید، ژنهای کدکننده شیگاتوکسین در شیگلا دیسانتری روی کروموزوم قرار دارند، درحالیکه در باکتری EHEC ژنهای کدکننده توکسین روی ژنوم باکتریوفاژ مستقر هستند، بدین منظور میتوان از روشهای متعددی استفاده نمود که در ادامه به برخی از آنها اشاره میگردد.

شانگرهای (پروب های) ژنتیکی
استفاده از روشهای مختلف PC
استفاده از روش PCR
استفاده از روش :Real T

محاسن روش PCR-ELISA

محدودیتهای موجود و معایب روشهای دیگر از جمله PCR را ندارد.
روش اختصاصی و سریع بوده و میتواند مدیریت کیفیت محصولات غذایی را در مقایسه با روشهای باکتری شناسی بهبود بخشد.
3از ویژگی دیگر این روش تشخیصی میتوان به امکان آنالیز همزمان تعداد زیاد نمونه ها با استفاده از میکروپلیتهای 96 خانه ای اشاره کرد که به خصوص در زمان شیوع همه گیری بسیار کاربرد دارد.

درمان و پیشگیری

درمان شیگلوز تأمین آب و الکترولیت است. در موارد خفیف تر تجویز آنتی بیوتیک لازم نیست، ولی در موارد شدیدتر سیپروفلوکسازین داروی انتخابی است. از آنجایی که مقاومت چند دارویی در این باکتری شایع بوده و توسط پلاسمید انتقال مییابد، باید سنجش حساسیت آنتی بیوتیکها صورت گیرد.

آمپیسیلین، تتراسایکلین، تریمتوپریم، سولفامتاکسازول و کلرامفنیکل مهارکننده شیگلا هستند. این آنتیبیوتیکها میتوانند حملات حاد بالینی دیسانتری را متوقف نموده و از طول مدت علائم بیماری بکاهند، ولی ممکن است نتوانند ارگانیسم را از روده ها ریشه کن کنند.

مصرف داروهای ضد پریستالتیسم و اوپیوئیدها در شیگلوز ممنوع است زیرا باعث طولانی شدن تب، اسهال و تداوم دوره دفع ارگانیسم میشود. در بالغین اغلب بدون درمان آنتی بیوتیکی بهبودی بوجود میآید، اما باید به طور کافی جایگزینی مایعات در آنها صورت گیرد.

عوامل ضد اسهالی به دلیل احتمال طولانی شدن دوره بیماری نباید تجویز شود. از آنجایی که انسان میزبان شناخته شده اصلی برای شیگلا است و این باکتری فقط در انسان ایجاد بیماری میکند و هیچ واکسنی علیه این بیماری در دسترس نیست، در نتیجه اقدامات پیشگیری بر چرخه انتقالی و حذف ارگانیسم از مخزن باید تمرکز پیدا کند.

این اقدامات شامل کنترل بهداشتی آب، غذا، شیر، تخلیه صحیح فاضلاب و کنترل حشرات است.ناقلهای انسانی باید شناسایی و درمان شوند و تعداد دفعات شستن دست با صابون افزایش یابد و مادران شیرده به جای استفاده از شیرخشک که با آب آلوده تهیه میشود، تشویق به استفاده از شیر خود برای تغذیه کودک خود شوند.

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.