کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی (تهیه سوش و آزمایشات بیوشیمی)

کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی:

اصطلاحات مربوط به سویه های میکروبی کنترل

  • سویه کنترل : میکروارگانیسمی که برای ارزیابی عملکرد میکروبی محیط کشت استفاده می شود.
  • سویه مرجع (Reference Strain): میکروارگانیسمی که حداقل تا سطح جنس و گونه شناسایی شده و بر اساس ویژگی ها و ترجیحاً منشا آن، فهرست بندی و تعریف شده است.
  • ذخیره های مرجع (Reference Stocks): کشت های بدست آمده از پاساژ سویه مرجعی که از مراکز بین المللی تهیه شده است.
  • ذخیره های کاری (Working Stocks): کشت مجددی که از کشت های ذخیره جهت کنترل کیفیت محیط های کشت استفاده می شود.

 

منبع سویه های کنترل:

همه سویه های کنترل که در جدول ۲ از آنها نام برده شده است، ATCC  می باشند

.(American type culture collection) این سوشها، حداقل سوشهایی هستند که باید برای ارزیابی هر محیط کشت استفاده شوند. ارگانیسم های مورد استفاده برای اهداف کنترل کیفی می تواند از سویه های National collection باشد. سویه های دیگری نیز ممکن است توسط سازنده محیط کشت به کار رود که شامل مجموعه ای از سویه های وحشی (Wild strain) یا بدست آمده از نمونه های بیمار می باشد که مختص هر آزمایشگاه بوده و برای انجام آزمایش های بیشتر به کار می روند.

روش انجام آزمون کنترل کیفیت محیط های کشت

تهیه سوسپانسیون میکروبی:

یک کشت از ارگانیسم کنترل کیفی روی پلیت بلادآگار تهیه کنید. بعد از انکوباسیون پلیت ۵-۳ کلنی ایزوله را در مقدار کمی تریپتیکیس سوی براث (TSB) استریل حل نمایید تا سوسپانسیون میکروبی حاصل شود و آن را برای چهار یا پنج ساعت انکوبه نمایید. سپس کدورت آن را با استاندارد نیم مک فارلند تنظیم کنید. (استاندارد نیم مک فارلند در طول موج ۶۲۵ nm، دارای جذب ۰۸/۰ تا ۱/۰ ناتومتر می باشد)

به جای این روش می توان مستقیماً از کلنی های ایزوله روی پلیت، سوسپانسیون میکروبی مطابق با کدورت نیم مک فارلند تهیه کرد. بدین ترتیب که ۵-۳ کلنی ایزوله روی پلیت ۲۴ ساعته را در ۵-۳ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل کرده و کدورت آن را با نیم مک فارلند تنظیم نمایید. با هر روشی که این سوسپانسیون میکروبی تهیه شود، باید کدورتی حاوی ۱۰۷-۱۰۸ CFU/ml کلنی داشته باشد. (مطابق با استاندارد نیم مک فارلند).

بررسی آزمایش های عملکردی محیط کشت (Performance testing)

۱- آزمایش ظرفیت مغذی بودن (Nutritional activity) محیط  های کشت پلیتی مانند بلاد آگار

سوسپانسیون اولیه را به نسبت ۱ به ۱۰۰ در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ ۱۰ یا ml 01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 104-103 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون را ده بار رقیق تر تهیه نمایید.

۲- آزمایش ظرفیت مهار کنندگی محیط های کشت انتخابی پلیتی مانند مکانکی آگار

سوسپانسیون اولیه را به نسبت ۱ به ۱۰ در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ ۱۰ یا       ml01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح  کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 105-104 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون ده بار رقیق تر تهیه شود.

۳- آزمایش محیط های کشت لوله ای

هر لوله باید با lµ ۱۰ یا  ml01/0 از سوسپانسیون اولیه تهیه شده مطابق با نیم مک فارلند (بدون رقیق سازی) تلقیح شود. گاهی ممکن است به تلقیح کمتر یا بیشتر نیاز باشد.

محیط مورد آزمون را بعد از تلقیح تحت شرایطی که در جدول ۲ آمده است، انکوبه نمایید. به طور نرمال  زمان انکوباسیون، ۲۴-۱۸ ساعت یا ۴۸-۲۴ ساعت در دمای Cº ۲±۳۵ می باشد. محیط شکلات آگار و سایر محیط های کشت برای جداسازی انتخابی گونه های نیسریای بیماریزا باید در ۱۰- ۵% Co2 انکوبه شوند و در فواصل زمانی۲۴-۱۸ ساعت وسپس ۴۸-۲۴ ساعت بررسی گردند.

برای باکتری های بی هوازی، کشتها عموماً به حداقل ۴۸ ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی و غنی از Co2 نیاز دارند.

در مورد کمپیلوباکتر آگار، پلیتها باید در Cº ۴۲ در شرایط میکروآئروفیلیک غنی از Co2 به مدت ۴۸ ساعت انکوبه شوند.

۴- کنترل محیط های کشت برای آزمایشهای بیوشیمیایی

از سوسپانسیون میکروبی رقیق نشده برای کنترل این محیطها استفاده می کنیم.

پس از تلقیح، تمام کشت ها را در شرایط لازم (از نظر Co2، رطوبت و یا شرایط بیهوازی و درجه حرارت مناسب) قرار داده و پس از طی مدت زمان لازم (۲۴ تا ۴۸ ساعت) آنها را مورد بررسی قرار می دهیم. محیط های مناسب دارای رشد کافی از کلنی های باکتریهای مورد نظر می باشند و در مورد محیطهای انتخابی مهار میکروارگانیسمهای مورد نظر باید مشخص باشد.

کنترل محیط های ساخته شده تجاری (آماده مصرف):

  • رطوبت: محیطهای کشت باید بدون هر گونه رطوبت اضافی بوده، همچنین هیچ نشانه ای از خشک شدن اطراف محیط کشت نباید مشاهده گردد.
  • سترون بودن: محیطهای کشت باید عاری ازآلودگی باشند.

رنگ: محیطهای کشت آگار خوندار نباید هیچ نشانه ای از همولیز داشته باشند و محیطهای کشت دیگر نباید هیچگونه تغییر رنگ غیر طبیعی داشته باشند.

بررسی آلودگی محیط های کشت (استریل بودن محیط های کشت):

در صورتیکه تعداد پلیت یا لوله تهیه شده در هر سری ساخت یا Lot، ۱۰۰ عدد یا کمتر باشد، باید به تعداد ۵-۳% محیط های تهیه شده را در دمای Cº ۳۷-۳۵ به مدت ۵-۲ روز انکوبه نمود. برای Lot های با تعداد بیش از ۱۰۰، باید به تعداد ۱۰ پلیت یا لوله را به طور تصادفی برداشته و در شرایط فوق انکوبه نمود. بعد از انکوباسیون هیچ گونه رشد میکروبی نباید مشاهده شود.

 

تفسیر نتایج:

یک محیط کشت زمانی قابل قبول می باشد که با همه سویه های پیشنهادی برای آزمون محیط کشت که در جدول ۲ مشخص شده است، رشد کافی داشته و خصوصیات مورفولوژیکی کلنی ها بارز باشد. در مورد محیط های انتخابی، رشد بعضی از ارگانیسم های خاص مهار می شود، ضمن اینکه اجازه رشد کافی به سایرارگانیسم می دهد. در بعضی موارد، واکنشهای رنگی خاص یا همولیز همچنانکه در جدول ۲ آمده است، باید ایجاد شود. مثلاً در مورد کشت بلادآگار ایجاد همولیز مناسب ضروری است و یا برای محیط مکانکی آگار ایجاد واکنش های رنگی برای سویه های میکروبی مشخص ضروری می باشد.

سایر معیارهای تضمین کیفیت:

محیطهای کشت آماده مصرف باید از نظرموارد زیر نیز بررسی شوند:

  • شکستگی ظروف پتری
  • پر شدن ناصاف پلیتها
  • ترک خوردگی محیط کشت در پلیتها
  • وجود همولیز (برای بلاد آگار)
  • یخ زدگی
  • وجود مقدار زیاد حباب یا حفره در سطح محیط کشت

جدول ۲

محیط کشتزمان انکوباسیونارگانیسم های کنترلینتیجه قابل انتظار
بایل اسکولین آگار۲۴ ساعتاسترپتوکوک فکالیس S. faecalis

 

استرپتوکوک پایوژنزS. pyogenes

رشد مثبت، محیط سیاهرنگ می شود

رشد منفی

بلاد آگار

جار شمع دار CO2

۲۴ ساعتاسترپتوکوک پایوژنز

Streptococcus pyogenes

 

استرپتوکوک پنومونیهS. pnemoniae

رشد مثبت دارای همولیزبتا

رشد مثبت دارای همولیز آلفا

شکلات آگار۲۴ ساعتهموفیلوس آنفلوانزا

Haemophilus influenzae

رشد مثبت
لایزین دکربوکسیلاز

(محیط بوسیله روغن استریل پوشانده میشود)

۴۸ ساعتسالمونلا تایفی موریوم S. typhimurium

 

شیگلافلکسنری Shigella flexneri

مثبت (بنفش رنگ می شود)

منفی (بدون تغییر رنگ)

اورنیتین

(دکربوکسیلاز)

۴۸ ساعتسالمونلا تایفی موریومS. typhimurium

 

کلبسیلا پنومونیه K. pneumoniae

مثبت

منفی

آرژینین
(دی هیدرولاز)
۴۸ ساعتسالمونلا تایفی موریوم S. typhimurium

 

پروتئوس میرابیلیسProteus mirabilis

مثبت

منفی

ژلاتیناز۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

باسیلوس سوبتیلیسBacillus subtilis

منفی

مثبت

کلایگلرآیرون آگار

 

۲۴ ساعتسیتروباکتر فروندیCitrobacter frundii

 

سالمونلا تایفی موریومS. typhimurium

 

شیگلا فلکسنری Sh. flexneri

 

اسینتوباکتر کالکوستیکوس

Acinetobacter calcoaceticus

گاز + A/A, SH2

گاز یا بدون گاز + K/A, SH2

K/A

تغییر نمی کند

مک کانکی آگار

(همراه با کریستال ویوله)

۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

پروتئوس میرابیلیسProteus mirabilis

 

استرپتوکوک فکالیس S. faecalis

کلنی های قرمز رنگ

کلنی های بیرنگ، بدون سوارمینگ (خزش)

رشد منفی

 

مالونات

 

۲۴ ساعت

اشرشیا کلی E. coli

 

کلبسیلا پنومونیهK. pneumonia

منفی (سبز رنگ)

مثبت (آبی رنگ)

مانیتول سالت آگار۲۴ ساعتاستافیلوکوک اورئوس S. aureus

 

 S. epidermidisاستافیلوکوک اپیدرمیدیس

 

اشرشیا کلی E. coli

کلنی های زرد رنگ

کلنی های قرمز رنگ

رشد منفی

MRVP۴۸ ساعتاشرشیا کلیE. coli

 

کلبسیلا پنومونیهK. pneumonia

MR مثبت- VP منفی

MR منفی- VP مثبت

مولرهینتون آگار۲۴ ساعتاستافیلوکوک اورئوس

S. aureus ATCC 25923

 

سودوموناس آئروژینوزا

P. aeruginosa ATCC 27853

اشرشیا کلی E. coli ATCC 25922

به جدول میزان هاله عدم رشد قابل قبول در بخش آنتی بیوگرام مراجعه شود
نیترات براث۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

اسینتوبا کتر کالکوستیکوس

Acinetobacter calcoaceticus

مثبت

منفی

آب پپتونه (اندول)۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

کلبسیلا پنومونیه K. pneumoniae

مثبت

منفی

فنیل آلانین دآمیناز۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

پروتئوس میرابیلیس  mirabilis. P

منفی

مثبت

سالمونلا شیگلا آگار (S.S)

یا دزوکسی کلات سیترات آگار

۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

سالمونلا تایفی موریوم

Salmonella typhimurium

 

یرسینیا انتروکولیتیکا

Yersinia enterocolitica

 

شیگلا فلکسنری Shigella flexneri

منفی

کلنی های بیرنگ

کلنی های بیرنگ

کلنی های بیرنگ

سلنیت برات

(SF)

۲۴ ساعتسالمونلا تایفی موریوم S. typhimurium

 

اشرشیا کلی E. coli

بعد از کشت مجدد رشد می کند

بعد از کشت مجدد رشد نمی کند

سیمون سیترات

(در لوله های با درپیچ شل در انکوباتور گذاشته شود)

۴۸ ساعتاشرشیا کلی  E. coli

 

کلبسیلا پنومونیهK. pneumonia

رشد منفی

رشد مثبت- رنگ آبی

TCBS آگار۲۴ ساعتVibrio SPP

 

کلنی های زرد رنگ
 

تایر مارتین

 

۲۴ ساعت

نایسریا مننژیتیدیس

 Neisseria meningitidis (CO2)

 

نایسریا گونورهN. Gonorrhoeae  

 

اشرشیا کلیE. coli

 

رشد مثبت

رشد مثبت

 

رشد منفی

تایوگلیکولات براث

Thioglycollate broth

۲۴ ساعتباکتروئیدس فراجیلیس

Bacteriodes fragilis

رشد مثبت
TSI

عمق محیط باید ۳ سانتی متر باشد

(با درپیچ شل اتوو گذاری شود)

۲۴ ساعتسیتروباکتر فروندی

Citrobacter frundii

 

سالمونلا تایفی موریومS. typhimurium

 

شیگلا فلکسنری Sh. flexneri

 

اسینتوباکتر کالکوستیکوس

Acinetobacter calcoaceticus

گاز + A/A, SH2

گاز یا بدون گاز + K/A, SH2

K/A

تغییر نمی کند

محیط اوره۲۴ ساعتاشرشیا کلی E. coli

 

پروتئوس میرابیلیس P. mirabilis

منفی

مثبت، صورتی

 

کنترل کیفی کورن میل آگار Corn Meal Agar

کاربرد: برای تحریک تولید کلامیدوسپور توسط اکثر استرین های کاندیدا آلبیکنس و برای کشت قار چهای فیتوپاتوژنیک بکار می رود.
شکل ظاهری محیط دهیدراته: زرد، روان و یکنواخت
محلول 7/ 1% قابل حل در آب مقطر و آب دیونیزه در دمای جوش
رنگ محلول: کهربائی روشن، کمی کدر و ممکن است رسوب بسیار ظریفی داشته باشد.
واکنش محلول 7/ 1% در دمای 25 درجه سانتی گراد: 0.2 ± pH: 6
محیط کورن میل آگار را طبق دستورالعمل روی آن تهیه کنید. تلقیح ارگانیسم تست بر روی سطح محیط انجام می شود. یک سوسپانسیون غلیظ از کاندیدا آلبیکنس تهیه نمایید.
یک لوپ استریل میکروبیولوژی را درون این سوسپانسیون فرو برده و سپس تلقیحی به شکل X و به اندازه ی 2 سانتیمتر در سطح آگار برش دهید. سپس یک لامل روی قسمت X قرار دهید و در دمای 20 الی 25 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 48 ساعت و در صورت نیاز تا 4 روز انکوبه نمایید،سپس پلیتها را برای مشاهده ی کلامیدوسپور مورد بررسی قرار دهید. درصورت یکه کلامیدوسپورها تولید شده باشند به شکل کره های دارای دو دیواره دیده می شوند.

کنترل کیفی چاپک دوکس آگار

کاربرد: برای کشت قارچ ها و باکتریهایی که قادر به استفاده از نیتروژن غیرآلی هستند بکار می رود.
فرم ظاهری محیط دهیدراته:بژ خیلی روشن، روان و یکنواخت
محلول 9/ 4%: قابل حل در آب مقطر و آب دیونیزه در دمای جوش، کهربائی روشن، کدر با رسوب یکنواخت
محیط کشت آماد ه شده: کهربائی روشن، کمی کدر، ممکن است کمی رسوب داشته باشد.
واکنش محلول 9/ 4% در دمای 25 درجه سانتی گراد: 0.2 ± pH: 7.3 مطابق دستورات روی ظرف محیط کشت را تهیه کنید، در لوله پخش کرده و لوله ها را با ارگانیسم های تست تلقیح کنید. محیط کشت تلقیح شده را در دمای 2± 30 درجه سانتیگراد به مدت 48 تا 72 ساعت انکوبه کنید.

کنترل کیفی محیط سیب زمینی دکستروز آگار

کاربرد: برای کشت مخمرها و کپ کها از محصولات غذائی و لبنی فرم ظاهری محیط دهیدراته:بژ روشن،روان و یکنواخت
محلول 9/ 3%: قاب لحل در آب مقطر و آب دیونیزه در دمای جوش،به رنگ کهربائی روشن، با کدورت خیلی کم
محیط آماده شده: کهربائی روشن، اندکی کدر
واکنش محلول 9/ 3% در دمای 25 درجه سانتی گراد: 0.2 ± pH: 5.6
مطابق دستورالعمل روی ظرف، محیط را تهیه کرده و ارگانیسم های تست را تلقیح نمایید. پلیتها را در دمای 2± 30 تا مدت 7 روز نگهداری کنید.

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.